氧化三甲胺促進(jìn)人主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)

楊 波，魏緒磐，蔡小玲，熊婉媛，哈小琴*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000; 2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 甘肅 蘭州 730050)

氧化三甲胺(trimetylamine oxide,TMAO)是一種主要由腸道菌群代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)，隨著對腸道微生態(tài)的不斷研究，它被發(fā)現(xiàn)與心腦血管疾病的發(fā)生有著密不可分的關(guān)系。臨床實(shí)驗(yàn)與相應(yīng)動物實(shí)驗(yàn)表明TMAO可以增加動脈粥樣硬化發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并且有促進(jìn)斑塊形成的作用[1-2]，但對其具體機(jī)制并不清楚。而動脈粥樣硬化和炎性反應(yīng)有密不可分的關(guān)系[3]，通過相關(guān)通路的激活，釋放炎性細(xì)胞因子，并進(jìn)一步引起血管炎性反應(yīng)，這被認(rèn)為是動脈粥樣硬化形成、發(fā)展的原因之一。TMAO被發(fā)現(xiàn)有明顯的促炎能力，它可以使脂肪組織中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)mRNA表達(dá)增高，以及有抗炎作用的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10) mRNA表達(dá)降低[4]，也可顯著引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)中白細(xì)胞介素-18(interleukin-18, IL-18)以劑量和時(shí)間依賴性的方式釋放[5]。

本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)和體外兩方面探究TMAO對動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)作用，并進(jìn)一步探究對炎性反應(yīng)信號通路NF-κB激活的情況，為研究TMAO通過炎性反應(yīng)促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動物：人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cells, HAECs)(Sciencell公司)；12只SPF級6周齡C57BL16小鼠(北京維通利華，合格證號：11400700242853)。

1.1.2 主要試劑：TMAO(Sigma-Aldrich公司)；兔抗p65、磷酸化p65抗體(CST公司)；鼠抗β-actin抗體、抗β-tubulin兔抗、蛋白磷酸酶抑制劑混合物(北京索萊寶公司)；RIPA蛋白裂解液、PMSF、BCA試劑盒、細(xì)胞核漿蛋白提取試劑盒、信號通路抑制劑BAY 11-7082(上海碧云天生物公司)；CCK-8試劑(日本同仁試劑公司)；PCR引物、RNAiso Plus、PrimeScript試劑盒(大連寶生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理：將小鼠分為對照組及TMAO組(腹腔注射1 000 μmol/L)，注射之前饑餓處理4 h，取腹主動脈組織進(jìn)行炎性因子mRNA檢測。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理：用含10%牛胎血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng) HAECs，每2 d換1次培養(yǎng)基。使用相應(yīng)濃度TMAO處理細(xì)胞，進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞生存率、mRNA以及蛋白檢測；用TMAO和信號通路抑制劑BAY 11-7082處理細(xì)胞，檢測炎性反應(yīng)因子mRNA表達(dá)情況。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞的存活率：在培養(yǎng)瓶中HAECs增殖到80%左右匯合時(shí)，種入96孔板，每孔種入5×103個(gè)細(xì)胞。后將其放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其穩(wěn)定，饑餓處理12 h，目的是使細(xì)胞達(dá)到完全同步。分別使用含1 000、3 000和5 000 μmol/L的TMAO培養(yǎng)基處理細(xì)胞24、48和72 h，加入含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱放置3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔的吸光度值，通過公式[(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.2.4 PCR法檢測炎性反應(yīng)因子mRNA水平：為了驗(yàn)證TMAO的促炎作用，體內(nèi)使用1 000 μmol/L處理0.5和1 h與未處理動物比較，檢測腹主動脈組織炎性反應(yīng)因子mRNA表達(dá)，體外用300 μmol/L TMAO處理3和6 h HAECs和未處理細(xì)胞比較，檢測細(xì)胞炎性反應(yīng)因子mRNA表達(dá)。使用RNAiso Plus、氯仿、異丙醇和75%的乙醇進(jìn)行RNA的提取，后進(jìn)行RNA濃度的測定。根據(jù)操作說明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，所得DNA根據(jù)操作說明進(jìn)行上樣前的處理，通過PCR在一定反應(yīng)條件下進(jìn)行相應(yīng)炎性反應(yīng)因子mRNA表達(dá)水平檢測，相應(yīng)引物見表1。

1.2.5 Western blot檢測NF-κB通路蛋白:使用300 μmol/L TMAO分別處理HAECs 0.5、1 和1.5 h提取蛋白，檢測NF-κB蛋白p65、磷酸化p65蛋白和p65蛋白入核情況，并與對照組比較。根據(jù)說明書操作提取蛋白，用RIPA裂解液、PMSF、 蛋白磷酸酶抑制劑混合物處理細(xì)胞，進(jìn)行蛋白濃度測定。使用細(xì)胞核漿蛋白提取試劑盒，逐步進(jìn)行細(xì)胞核、漿蛋白的提取。取蛋白10 μL在10%的PAGE-SDS凝膠中進(jìn)行電泳與電轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜上。使用5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗(actin 1∶5 000、β-tubulin 1∶2 000、p65 1∶1 000、磷酸化p65 1∶1 000)稀釋于TBST之中，并且4℃進(jìn)行孵育過夜。次日孵育抗兔或抗鼠二抗(1∶10 000)1 h，然后進(jìn)行曝光和吸光度值分析。

表1 相應(yīng)炎性因子的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測HAECs生存率

與對照組相比，1 000、3 000 和5 000 μmol/L TMAO處理細(xì)胞后，細(xì)胞生存率有明顯下降(P<0.01)(表2)，并且存在一定的濃度依賴性與時(shí)間依賴性。

表2 不同濃度TMAO處理后主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的生存率

*P<0.01 compared with control group.

2.2 PCR檢測小鼠組織mRNA的表達(dá)

用1 000 μmol/L TMAO處理0.5 和1 h后的小鼠組織與對照組相比，炎性反應(yīng)因子VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α mRNA表達(dá)提高(P<0.05)(圖1A)。

2.3 PCR檢測HAECs mRNA的表達(dá)

300 μmol/L TMAO處理3和6 h和未處理細(xì)胞比較，炎性反應(yīng)因子VCAM-1、MCP-1、IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA 表達(dá)都有明顯的提高(P<0.05)(圖1B)。

2.4 Western blot檢測HAECs NF-κB通路蛋白表達(dá)

TMAO處理1和1.5 h NF-κB磷酸化p65蛋白/p65蛋白比例明顯增高，(P<0.05)(圖2A,C)，并且1.5 h蛋白表達(dá)最高；處理組核蛋白較未處理組明顯提高(P<0.05)(圖2B,D)。

2.5 TMAO與NF-κB抑制劑處理HAECs后檢測炎性因子表達(dá)

300 μmol/L TMAO處理 3 h和抑制劑處理組細(xì)胞比較，炎性因子IL-1β、COX-2、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)都有明顯的提高(P<0.05)(圖3)。

A.treated aortic endothelial cells with 300 μmol/L TMAO for 3 hours and 6 hours, then detected the expression of inflammatory cytokines; B.1000 μmol/L TMAO was intraperitoneally injected, 0.5 hour and 1 hour respectively, the mRNA expression of inflammatory cytokines in the abdominal aorta was taken; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.expression of phosphorylated p65 and total p65 protein in the NF-κB signaling pathway after treatment with 300 μmol/L TMAO at different time points; B.gray levels of phosphorylated p65 and total p65 protein expression analysis; C.300 μmol/L TMAO treatment for 1.5 hours, expression of p65 protein in nucler and cytoplasm; D.analysis of p65 nuclear and cytoplasm expression in gray value; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

Treatment of aortic endothelial cells with NF-κB inhibitors and TMAO showed no significant difference in TMAO+NF-κB inhibitor-treated cells compared with the control group, and there was a difference between the TMAO-treated group and the control group; *P<0.05 compared with control group圖3 TMAO與NF-κB抑制劑處理細(xì)胞后炎性因子表達(dá)Fig 3 Expression of inflammatory factors after treatment with TMAO and NF-κB

3 討論

TMAO是腸道微生物的代謝產(chǎn)物，在多種疾病狀態(tài)下由于腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，其在血液中的含量增高，并與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。TMAO在正常人體血液中濃度為0.73～126 μmol/L，在疾病狀態(tài)下可達(dá)到500 μmol/L左右[5]。本實(shí)驗(yàn)首先觀察了它的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)在1 000～5 000 μmol/L時(shí)，TMAO具有明顯的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6]以及濃度梯度的篩選，設(shè)定的細(xì)胞處理濃度為300 μmol/L。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)沒有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)敏感，篩選出1 000 μmol/L為處理濃度。目前尚沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其自身的毒性作用，而在腎臟和肝臟這些可以蓄積TMAO的器官，TMAO的毒性應(yīng)該在研究中得到足夠的重視。

此外，也有臨床實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)血液TMAO濃度較高的人群中，其動脈粥樣硬化的發(fā)生率較高[7]，TMAO可以增加巨噬細(xì)胞膽固醇負(fù)荷和動脈粥樣硬化斑塊的形成[8]，但TMAO促進(jìn)動脈粥樣硬化的機(jī)制并不清楚。有研究表明TMAO可以引起血液中TNF-α、IL-6和C-反應(yīng)蛋白等因子增加，這表明TMAO具有一定的促炎作用[9]。本實(shí)驗(yàn)就通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TMAO可以引起小鼠腹主動脈和HAECs的炎性反應(yīng)因子的表達(dá)增加，說明TMAO可以促進(jìn)HAECs的炎性反應(yīng)。TMAO的促炎作用可能是其促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，并且TMAO的促炎作用不光在動脈粥樣硬化中值得研究，在其他TMAO升高的疾病中，也應(yīng)該考慮到它除了作為疾病標(biāo)志物以外的其他作用。

NF-κB信號通路是經(jīng)典的炎性信號通路，并且也與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中，多種因素可以通過MAPK、TLR、ROS依賴性通路進(jìn)而活化NF-κB信號通路，從而引起炎性反應(yīng)[12-14]。本實(shí)驗(yàn)對NF-κB信號通路蛋白以及入核情況進(jìn)行檢測，證明TMAO可以激活NF-κB信號通路。然而NF-κB通路在正常細(xì)胞凋亡、生長以及腫瘤細(xì)胞增殖等方面都有一定影響，此通路的激活也不能完全說明對炎性反應(yīng)有刺激作用。當(dāng)使用NF-κB抑制劑BAY 11-7082處理細(xì)胞后，相應(yīng)炎性反應(yīng)因子表達(dá)不上升，進(jìn)一步表明，NF-κB信號通路是TMAO激活炎性因子表達(dá)的關(guān)鍵途徑。

綜上所述本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)和體外水平對TMAO促炎作用以及機(jī)制進(jìn)行了探究，初步研究證明了TMAO可以通過NF-κB信號通路來刺激炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，這為后期探究TMAO對動脈粥樣硬化的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。