miR-548p表達(dá)上調(diào)抑制卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3的增殖和遷移

古力米熱·布然江，熱孜亞·庫爾班，艾力克木·阿不都玩克，李小文，古麗娜·庫爾班*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院(附屬腫瘤醫(yī)院), 新疆 烏魯木齊 830011； 2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830001)

卵巢癌是常見婦科惡性腫瘤之一，其病死率居于婦科惡性腫瘤之首[1]。由于發(fā)病早期無顯著癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已處于晚期，導(dǎo)致該病具有較高的致死率[2]。由于該腫瘤有較高的早期侵襲及轉(zhuǎn)移能力，即使手術(shù)治療后，患者的預(yù)后多不良[3]。因此，研究與卵巢癌進(jìn)展相關(guān)的基因以及相關(guān)的機(jī)制是目前治療卵巢癌的熱點(diǎn)，同時(shí)對(duì)患者前期診斷也具有極其重要的意義。

近年來，越來越多的研究表明微小RNA(microRNAs，miRNAs)可通過與靶基因mRNA的非編碼區(qū)相互結(jié)合，通過對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的翻譯，最終影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮類似于癌基因或者抑癌基因的功能[4]。miR-548p作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的微小RNA，可通過下調(diào)乙型肝炎病毒X相關(guān)蛋白，進(jìn)而抑制乙型肝炎病毒X蛋白相關(guān)的肝細(xì)胞癌的進(jìn)展，也可抑制肝臟載脂蛋白B的分泌和脂質(zhì)合成[5]。然而，有關(guān)miR-548p在卵巢癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制的研究報(bào)道甚少，本文主要研究miR-548p對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響，并探討其可能機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

組織樣本：收集2016年9月到2017年6月30例新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院卵巢癌組織樣本，立即加入Trizol試劑(TakaRa公司)，并采用組織勻漿機(jī)粉碎后保存在-80 ℃，避免RNA的降解。所有患者均知情同意，并且本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3、HO-8910、OVCR3、A2780和人卵巢上皮細(xì)胞IOSE80(ATCC公司)；PrimeScript Reverse Transcriptase、SYBR Green Real time-PCR試劑盒、Trizol(TakaRa公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；Transwell小室(Corning公司)；MTT試劑盒(R&D 公司)；MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、p-p65、GAPDH抗體和兔抗鼠的二抗(CST公司)；miR-548p mimics以及control質(zhì)粒(Sigma-aldrich公司)；miR-548引物(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)80%～90%時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所有轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(RT-qPCR)檢測mRNA：嚴(yán)按說明書進(jìn)行臨床組織樣本以及卵巢癌細(xì)胞等總RNA的提取后，使用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并采用試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測。

1.2.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell的上室加入500 μL 8×103個(gè)/mL SKOV-3細(xì)胞無血清懸液后，放置于含20% FBS培養(yǎng)基的24孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，棉簽輕柔擦拭室內(nèi)多余的細(xì)胞，然后采用100%甲醇固定15 min，PBS沖洗后，采用0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，干燥后，在200倍鏡下觀察，分別選取上、下、左、右和中5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均數(shù)作為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 Western blot檢測蛋白：收集提取轉(zhuǎn)染miR-548p mimics以及control質(zhì)粒24 h后的SKOV-3細(xì)胞，用冷的PBS洗滌3遍后，加入蛋白裂解液，冰浴裂解60 min后，14 000×g離心10 min后獲取上清并加入5×上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min后保存于-20 ℃。采用12%的分離膠，5%的濃縮膠電泳分離20 μg蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉1 h，以1∶1 000濃度的一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌5次，每次5 min后，加入1∶3 000的二抗室溫下孵育2 h，再次PBST洗滌后，進(jìn)行顯影及定影，并拍片。

1.2.5 MTT法檢測增殖：用含10% FBS培養(yǎng)液重懸配成單細(xì)胞懸液，以每孔4 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，體積200 μL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12、24、48和72 h后，加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄掉上層培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，于490 nm處讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-548p在卵巢癌組織及細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況

miR-548p在卵巢癌腫瘤組織的表達(dá)量顯著低于相鄰的非腫瘤組織(P<0.05)(圖1A)。miR-548p在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于正常人卵巢上皮細(xì)胞(P<0.05)(圖1B)，其中以SKOV-3中的表達(dá)量最低，因此選取該細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)的一系列試驗(yàn)。

2.2 miR-548p抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移

miR-548p過表達(dá)后顯著抑制SKOV-3細(xì)胞增殖(圖2A,B)；在48 h細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01)(圖2C，D)。

2.3 miR-548p對(duì)SKOV-3細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶以及線粒體凋亡途徑蛋白的影響

在SKOV-3細(xì)胞中， miR-548p mimics轉(zhuǎn)染后,MMP-2和MMP-9的表達(dá)分別被抑制約69.8%和59.1%(圖3A，B)；Bcl-2的表達(dá)被抑制約60.3%，Bax的表達(dá)則上調(diào)117.8%(圖3C，D)。

A.expression of miR-548p was detected by RT-qPCR in clinical ovarian cancer tissues and adjacent normal tissues(n=30), #P<0.01 compared with non-tumor tissue group；B.RT-qPCR was used to explore the miR-548p expression in normal ovarian epithelial cells IOSE80, ovarian cancer cell lines A2780, OVCR3, HO-8910 and SKOV-3； *P<0.01 compared with IOSE80

A.RT-qPCR assay was used to detect the expression of miR-548p after transfeected with control or miR-548p mimics for 24 hours; B.effect of miR-548p on SKOV-3 was detected using MTT assay, 1×104 cells were seeded into 96-well plates after transfected with control or miR-548p mimics, OD values were read at 490 nm at 12, 24, 48 and 72 hours respectively; C,D.Transwell assay was used to test the migratory abilities of SKOV3 by miR-548p treatment(×400); *P<0.01 compared with SKOV-3

2.4 miR-548p對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

miR-548p過表達(dá)后可顯著抑制SKOV-3細(xì)胞中p65磷酸化水平，減少了約68%(圖4)。

Western blot was used to explore the influence of miR-548p on the expression of MMP-2, MMP-9, Bcl-2 and Bax in SKOV-3 cells after transfected with miR-548p mimics for 24 hours; A,B.detection of MMP-2 and MMP-9 expression; C,D.changes of Bcl-2 and Bax in SKOV-3 cells; *P<0.01 compared with SKOV-3

Western blot was used to explore the effect of miR-548p on the phosphorylation of p65 in SKOV-3 cells after transfected with miR-548p mimics for 24 hours; A.detection of p65 phosphorylation; B.relative expression of p65 phosphorylation; *P<0.01 compared with SKOV-3

3 討論

近年來，盡管卵巢癌的相關(guān)臨床治療及技術(shù)手段已取得較大的進(jìn)步和提高，但由于發(fā)病早期缺乏有效的診斷方法，病發(fā)時(shí)多數(shù)已有腹腔內(nèi)大面積擴(kuò)散，因此需要探尋針對(duì)卵巢癌臨床治療的靶點(diǎn)[1-3]。MicroRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類可通過調(diào)控靶基因參與信號(hào)通路進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的非編碼小分子RNA[4]。目前，microRNAs的表達(dá)譜已作為某些疾病的診斷，例如：膽汁的microRNA表達(dá)譜分析可以鑒別出膽管癌的早期階段[6]；miR-122在膽固醇代謝、肝細(xì)胞癌和丙肝病毒感染中起著重要作用[7]。在卵巢癌的診斷中，也發(fā)現(xiàn)許多不同的microRNAs具有重要的意義，例如：miR-150可作為晚期卵巢癌的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)[8]。然而，miR-548p作為最近新發(fā)現(xiàn)的微小RNA，其在卵巢癌中的作用目前沒有相關(guān)報(bào)道。在本研究中，發(fā)現(xiàn)miR-548p在卵巢癌組織及相關(guān)的細(xì)胞系中處于低表達(dá)狀態(tài)，這些均說明miR-548p可能參與到卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中，有望成為卵巢癌治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

卵巢癌的高侵襲和轉(zhuǎn)移性導(dǎo)致其具有較高的致病性及較差的預(yù)后。研究表明microRNAs可通過MMP-2和MMP-9調(diào)控卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，例如miR-340過表達(dá)可通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)從而抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和EMT過程[9]。MMP-2和MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，為一類蛋白水解酶，可降解胞外的基質(zhì)，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。研究表明MMP-2和MMP-9在卵巢癌中處于高表達(dá)，與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移以及卵巢癌的發(fā)展過程等相關(guān)[10]。本研究中，miR-548p過表達(dá)后可顯著抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，相應(yīng)地卵巢癌細(xì)胞的遷移也被顯著抑制，miR-548p可通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)從而抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移能力，發(fā)揮抑癌基因的作用。

細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系一直是近年來關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一，細(xì)胞凋亡程序的失控最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限繁殖，Bcl-2家族在該過程中發(fā)揮的作用備受關(guān)注。Bcl-2和Bax為Bcl-2家族的主要成員之一，可參與線粒體途徑的細(xì)胞凋亡調(diào)控[11]。凋亡相關(guān)基因的表達(dá)異常通常導(dǎo)致腫瘤過程的進(jìn)展，主要表現(xiàn)在促凋亡蛋白的表達(dá)下調(diào)，抗凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)[12]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)miR-548p過表達(dá)后可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中促凋亡蛋白Bax表達(dá)的上調(diào)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，這些表明miR-548p在卵巢癌細(xì)胞凋亡中具有重要的作用。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，該信號(hào)通路可參與調(diào)控凋亡相關(guān)基因、原癌基因以及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因等，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)[13-14]。P65作為NF-κB信號(hào)通路一個(gè)重要的成員，同樣在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。研究表明高磷酸化的p65參與了上皮性卵巢癌的淋巴轉(zhuǎn)移過程，并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-548p過表達(dá)時(shí)可顯著抑制p65的磷酸化，該結(jié)果表明了miR-548p可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路，從而下調(diào)MMP-2、MMP-9和Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移的影響，再一次證明了miR-548p參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程，并發(fā)揮抑癌基因的作用。

然而，miR-548p是如何調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，以及是否還有其他的信號(hào)通路參與這一過程，將是進(jìn)一步需要探索的問題。