葛根素減輕七氟烷對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞H4的損傷

朱桂紅，甯交琳，魯開智

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 手術(shù)麻醉科， 重慶 400038)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是神經(jīng)系統(tǒng)的一種慢性退行性疾病，臨床常表現(xiàn)為記憶力減退和認(rèn)知功能障礙，以腦內(nèi)β淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積為特征。吸入性麻醉藥可促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展[1]。H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞常用來作為AD的細(xì)胞模型，異氟烷和七氟烷均可促進(jìn)H4細(xì)胞中的Aβ的累積[2-3]。七氟烷是目前應(yīng)用最多的吸入性麻醉藥。研究表明，七氟烷可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)[4]，并可以影響AD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵蛋白Tau的磷酸化[1,5]，這些作用都可能導(dǎo)致AD的產(chǎn)生或加重。但目前為止，仍缺乏有效的藥物來防治圍術(shù)期全麻藥導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙。葛根素(puerarin)是從中藥葛根中提取的活性成分，是一種植物雌激素。有研究表明，葛根素可以減輕注射Aβ大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡和認(rèn)知障礙[6]。本研究擬探討葛根素對七氟烷所致的H4細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(上海北諾生物科技有限公司)。用含10%的胎牛血清(Gibco公司)、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。

1.1.2 試劑：CCK8試劑盒(Dojindo公司)；Annexin V-FITC凋亡試劑盒(貝博生物公司)；caspase 3酶活性檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒(碧云天生物公司)；MDA和SOD檢測試劑盒(南京建成生物科技公司)；抗BACE1抗體(Sigma-Aldrich公司)；抗β-actin抗體、二抗、ECL顯色液(索萊寶科技公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：將H4細(xì)胞分為4組：對照組、葛根素組(加入100 μmol/L葛根素培養(yǎng)6 h)、七氟烷組(4.1%七氟烷培養(yǎng)6 h)和葛根素干預(yù)組(在七氟烷刺激前1 h加入100 μmol/L葛根素，并培養(yǎng)6 h)。

1.2.2 CCK8法檢測細(xì)胞活性：將H4細(xì)胞按2.0×103個/孔接種于96孔板，各組6孔，過夜貼壁后，按上述分組處理后，每孔加10 μL CCK8試劑后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，并于A450處檢測吸光度(A)值。

1.2.3 流式細(xì)胞計量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明，收集處理后的H4細(xì)胞，冷PBS洗滌兩次，用400 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞至1×106cells/mL，加入5 μL annexin V-FITC，混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min。隨后加入PI混勻2～8 ℃避光孵育5 min。流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 Caspase 3活性的測定：按caspase 3酶活性檢測試劑盒說明，收集細(xì)胞并裂解，加入試劑盒底物，37 ℃孵育2 h后，酶標(biāo)儀測405 nm波長時各組吸光度值。

1.2.5 ROS的測定：根據(jù)活性氧檢測試劑盒說明，細(xì)胞接受相應(yīng)處理后，PBS洗滌3次，培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA至10 μmol/L，加入細(xì)胞，37 ℃孵育20 min，洗滌3次后用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度(488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長)。

1.2.6 MDA和SOD的測定：將細(xì)胞按1.5×105cells/mL接種于24孔板，過夜細(xì)胞貼壁后，按上述分組處理，按MDA和SOD檢測試劑盒測定。

1.2.7 Western blot檢測BACE1的表達(dá)：細(xì)胞接受相應(yīng)處理后，收集并裂解，用BCA法測定總蛋白濃度，按每孔40 μg上樣并進(jìn)行SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育過夜，TBST洗3次后，二抗孵育2 h，TBST洗3次后ECL顯色后置于Bio-Rad成像儀中分析條帶吸光度值。 抗BACE1抗體稀釋至1∶1 000，β-actin二抗稀釋至1∶2 500，ECL顯色后置于Bio-Rad成像儀中分析條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性比較

與對照組相比，七氟烷組細(xì)胞活性明顯下降(P<0.01)；與七氟烷組相比，葛根素干預(yù)組的細(xì)胞活性明顯回升(P<0.01)(表1)。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率及caspase 3活性比較

與對照組相比，七氟烷可明顯增加細(xì)胞caspase 3的活化和細(xì)胞凋亡率(P<0.01)；與七氟烷相比，提前加入葛根素的細(xì)胞caspase 3活化則明顯減輕(P<0.01)，凋亡率明顯減少(P<0.01)(表2，圖1)。

表1 各組細(xì)胞的活性

*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with sevoflurane group.

表2 各組細(xì)胞caspase 3活性和凋亡率

*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with sevoflurane group.

圖1 各組細(xì)胞的凋亡率Fig 1 Apoptosis rate in each group of cells

2.3 各組細(xì)胞BACE1表達(dá)量比較

與對照組比較，七氟烷可明顯增加細(xì)胞BACE1的表達(dá)(P<0.01)；與七氟烷組相比，葛根素預(yù)處理組的細(xì)胞BACE1表達(dá)明顯回降(P<0.01)(圖2)。

*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with sevoflurane group圖2 各組細(xì)胞BACE1的表達(dá)Fig 2 Expression of BACE1 in each group of cells

2.4 各組細(xì)胞ROS、MDA及SOD水平比較

與對照組比較，七氟烷可明顯增加細(xì)胞ROS和MDA的量(P<0.01)，減少SOD的水平；與七氟烷組相比，葛根素預(yù)處理組的細(xì)胞ROS和MDA產(chǎn)生量明顯下降(P<0.01)，SOD則明顯增加(P<0.01) (表3)。

表3 各組細(xì)胞ROS、MDA及SOD水平的比較

*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with sevoflurane group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)葛根素可以有效緩解七氟烷導(dǎo)致H4細(xì)胞的損傷，明顯減少了細(xì)胞的凋亡、caspase3的活性、ROS的產(chǎn)生及BACE1的產(chǎn)生。

AD發(fā)生的主要原因是腦內(nèi)β淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積，Aβ是由淀粉樣蛋白前體(β-amyloid precursor protein, APP) 經(jīng)β-和 γ-分泌酶水解而產(chǎn)生,而β-淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶1(BACE1)則是其中的一個關(guān)鍵酶。有研究表明，七氟烷和異氟烷可以增加神經(jīng)細(xì)胞中BACE1的表達(dá)[3,7]，本研究也得到了同樣的結(jié)果。而葛根素可以明顯減少BACE1的表達(dá)，從而減少了Aβ的產(chǎn)生。

細(xì)胞凋亡也在AD的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用，本研究用4.1%七氟烷培養(yǎng)細(xì)胞6 h[2]，發(fā)現(xiàn)七氟烷可以明顯增加H4細(xì)胞的凋亡率和caspase3的活化，結(jié)果顯示葛根素可以有效緩解七氟烷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。據(jù)報道，葛根素具有減輕Aβ致PC12細(xì)胞凋亡的作用[8-9]。異氟烷可以通過增加H4細(xì)胞中BACE1的表達(dá)而增加Aβ的產(chǎn)生[10]，從而促使細(xì)胞凋亡，因此，葛根素可能是通過減少BACE1的表達(dá)來減少H4細(xì)胞凋亡的。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是AD的另一病理生理機(jī)制,在AD的發(fā)展中，線粒體功能的紊亂和炎性反應(yīng)均導(dǎo)致了ROS的累積，進(jìn)而加重AD的進(jìn)程[11-12]。ROS的累積和活性自由基的增加導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成MDA，并損耗抗氧化酶(如SOD)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。本研究表明七氟烷可導(dǎo)致H4細(xì)胞中的ROS和MDA增加，SOD減少，而葛根素則顯著減少ROS和MDA的產(chǎn)生，減少SOD的消耗。這表明葛根素具有抑制七氟烷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。

綜上所述，葛根素可以明顯減少七氟烷所致的H4細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并減少BACE1的表達(dá)，這表明葛根素極有可能在圍術(shù)期AD的防治中成為一種新藥。