RNA甲基化“閱讀器”蛋白YTHDF2在急性髓系白血病中的作用

曹麗霞，陳連香

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

RNA是遺傳信息的重要傳遞者和調(diào)控者，在基因表達及調(diào)控中扮演著重要角色。近年來，科學家們在高等真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種普遍存在的、可逆的RNA甲基化修飾類型：6-甲基腺嘌呤(m6A)。隨后，研究人員陸續(xù)揭示了哺乳動物細胞內(nèi)參與這種動態(tài)修飾所需的“書寫器”(writer)、“擦除器”(eraser)和“閱讀器”(reader) 等相關(guān)蛋白，并發(fā)現(xiàn)了m6A在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的新機制。不僅如此，m6A修飾還廣泛參與了多種生理和病理過程的調(diào)節(jié)，如胚胎干細胞多能性維持、細胞增殖、配子發(fā)生、生物節(jié)律調(diào)控以及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-3]。YTHDF2是近年來被鑒定的可以作為“閱讀器”的蛋白，特異性識別轉(zhuǎn)錄本上m6A修飾位點。YTHDF2識別m6A修飾位點后，可通過對靶RNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，參與一系列生理或病理過程的調(diào)控[4-5]。但是，關(guān)于YTHDF2與急性髓系白血病(AML)之間的關(guān)系還未有研究報道。因此，本研究旨在通過考察YTHDF2在AML患者與正常人外周血單個核細胞中的表達差異，進一步研究其調(diào)控AML細胞功能的表型和分子機制，為進一步闡明m6A在不同類型腫瘤發(fā)生中的具體功能，解析m6A“閱讀器”蛋白YTHDF2參與白血病發(fā)生發(fā)展的作用和機制提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 急性髓系白血病樣本和急性髓系白血病細胞系：急性髓系白血病外周血血液樣本來自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液內(nèi)科采集并收集整理的初診標本(2010-2017年)。本項目所用臨床樣本的取得已獲得內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會的審查批準(免除知情同意書)。THP-1細胞系(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。

1.1.2 試劑：1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司)；Trizol Total RNA提取試劑盒和Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)； EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)；合成小干擾RNA(siRNA)分子(廣州銳博科技生物有限公司)；兔抗YTHDF2單克隆抗體(CST公司)；小鼠抗MZF1單克隆抗體和小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(Abcam公司)；流式抗體CD14(eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理：分別收集AML患者及正常人對照的外周血樣本作為實驗組和對照組，分離單個核細胞后，用PBS洗滌1遍，加入1 mL Trizol, 充分勻漿后，室溫放置5～10 min。隨后加入200 μL氯仿，充分顛倒混勻后，室溫放置5～10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。輕輕轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，隨后加入500 μL異丙醇，充分顛倒混勻后，室溫放置5～10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。輕輕棄掉上清后，加入750 μL 75%乙醇洗滌RNA沉淀1遍，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min。輕輕棄去乙醇，室溫放置干燥，DEPC·H2O溶解RNA沉淀。紫外吸光光度法測定RNA濃度，儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 實時定量PCR檢測基因 mRNA的表達水平：取2 μg上述提取的RNA，加入1 μL RT引物，1 μL反轉(zhuǎn)錄底物dNTP，并使用DEPC·H2O補齊至總體積為12 μL，并充分混勻，隨后加入2×反應緩沖液10 μL，1 μL RNA酶抑制劑(RNase inhibitor)和1 μL EasyScript Enzyme mix。42 ℃水浴孵育40 min。70 ℃水浴5 min滅活EasyScript Enzyme Mix。

實時定量PCR檢測使用下列引物(表1)進行PCR擴增。實時定量PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)；實時定量PCR熔解曲線的程序設(shè)定為：95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

1.2.3 THP-1細胞轉(zhuǎn)染：將THP-1細胞使用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染操作前，計數(shù)2×105個THP-1細胞接種于6孔板中，用不含血清的1640培養(yǎng)過夜，使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，按照100 pmol/孔進行siRNAs轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作6 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并按照不同間隔的時間點收集轉(zhuǎn)染后細胞。

表1 實時定量 PCR所用引物Table 1 Quantitative RT-PCR primer sequences

1.2.4 AcD處理細胞的RNA穩(wěn)定性檢測：使用1 μg/μL的放線菌素D(actinomycin D)處理THP-1細胞，分別收取0、3 和6 h的細胞，提取總RNA，使用實時定量PCR方法檢測不同時間點RNA水平，以處理0 h為基準，觀察處理后目標mRNA的下降速度，得到穩(wěn)定性曲線。

1.2.5 Western blot檢測YTHDF2和MZF1的表達：THP-1細胞使用預冷的PBS洗滌兩遍，棄上清后，使用約200 μL RIPA細胞裂解液裂解細胞， 冰浴30 min，期間每隔10 min混勻1次，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集上清至新管。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE；電轉(zhuǎn)膜后，使用含5%BSA的TBST緩沖液，室溫封閉2 h；1∶1 000稀釋的抗YTHDF2抗體或1∶2 000稀釋的抗MZF1一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后，加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫溫育2 h；TBST洗膜后加入ECL試劑，顯影和曝光。以GAPDH作為內(nèi)參照，比較實驗組和處理組，吸光度值掃描YTHDF2顯影條帶的深淺和面積進行定量計算。

1.2.6 CCK-8法檢測THP-1細胞增殖：THP-1細胞轉(zhuǎn)染siRNA 6 h后，重懸于新鮮的1640培養(yǎng)基中，按照1×104細胞/孔鋪于96孔板中，每組3個復孔。間隔24 h，用CCK-8試劑盒，每孔加入10 μL CCK-8, 繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，利用酶標儀測定450 nm/630 nm處的吸光度值，繪制細胞增殖曲線。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測THP-1單核細胞分化：THP-1細胞轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后，加入PMA誘導其向單核系分化24 h，隨后收集THP-1細胞，并使用預冷的PBS洗細胞兩遍。使用100 μL含有0.01% BSA的PBS重懸細胞，并加入10 μL稀釋后的CD14抗體，4 ℃避光孵育30 min，其間每隔10 min混勻1次。染色結(jié)束后，使用500 μL PBS洗滌細胞一遍，行流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 YTHDF2 mRNA在AML患者外周血單個核細胞中的表達升高

YTHDF2 mRNA的表達水平在36例AML患者的外周血單個核細胞中的表達水平顯著高于平行操作的對照組正常人(P<0.05)(圖1A)。此外， YTHDF2 mRNA的表達水平在多個AML來源細胞系中也普遍高于正常人對照(P<0.05)(圖1B),并以THP-1細胞系中的表達升高最為顯著。

A.relative expression level of YTHDF2 mRNA in AML patients compared to normal controls; *P<0.05 compared with normal controls; B.relative expression level of YTHDF2 mRNA in AML cell lines compared to normal controls

2.2 敲低內(nèi)源性YTHDF2的表達抑制THP-1細胞增殖并促進THP-1向單核系分化

使用針對YTHDF2 的siRNA(si-YTHDF2)轉(zhuǎn)染THP-1細胞，實現(xiàn)內(nèi)源性YTHDF2 mRNA(圖2A)(P<0.05)和蛋白水平(圖2B)的表達降低。CCK-8增殖檢測結(jié)果顯示，敲低內(nèi)源性YTHDF2的表達可以顯著抑制THP-1細胞的增殖活性(圖2C)。與此同時，與對照相比，敲低內(nèi)源性YTHDF2的表達可以顯著提高CD14陽性THP-1細胞的比例，顯示為促進PMA誘導的THP-1細胞向單核系分化(圖2D)。

2.3 YTHDF2通過調(diào)節(jié)MZF1 mRNA的穩(wěn)定性抑制MZF1的表達

Real-time PCR方法檢測放線菌素D處理前后，PPARD、SLC11A1、MZF1的mRNA穩(wěn)定性的改變，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-YTHDF2的THP-1細胞中，只有MZF1 mRNA的穩(wěn)定性與對照相比顯著降低(圖3A)。Western blot檢測也顯示，轉(zhuǎn)染si-YTHDF2的THP-1細胞中，MZF1蛋白質(zhì)水平也顯著降低(圖3B)，說明YTHDF2可以通過影響MZF1 mRNA的穩(wěn)定性而靶向抑制MZF1的表達。MZF1 mRNA在上述36例AML患者的外周血單個核細胞中的表達結(jié)果顯示，與YTHDF2類似，MZF1 mRNA也顯著高于對照組正常人(圖3C)(P<0.05)。

3 討論

急性髓系白血病(AML)是一類嚴重影響人們健康的高發(fā)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，雖然傳統(tǒng)放化療手段在AML治療上取得一定成效，但在提高初治緩解率和克服緩解后復發(fā)等方面仍存在眾多局限性。近年來，隨著對AML分子生物學研究的深入，發(fā)現(xiàn)眾多轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子越來越多地參與AML的發(fā)生發(fā)展，它們的異?；罨蚴Щ顣苯訉е录毎麅?nèi)轉(zhuǎn)錄后水平基因表達調(diào)控的紊亂，從而最終導致疾病發(fā)生。而針對上述異常改變的靶向藥物的出現(xiàn)，在一定程度上改善了AML患者的預后,為AML治療提供了新的途徑[7-8]。

A.relative expression of YTHDF2 mRNA in THP-1 transfected with si-YTHDF2 and control; *P<0.05 compared with control; B.expression of YTHDF2 protein in THP-1 transfected with si-YTHDF2 and control; C.CCK-8 analysis of THP-1 transfected with si-YTHDF2 and control; *P<0.05 compared with control; D.FACS analysis of THP-1 surface marker CD14 expression

A.effects of YTHDF2 knock-down on mRNA stability in THP-1 cells transfected with si-YTHDF2 and control (0, 3, 6 hours: AcD treatment time); B.Western blot analysis of MZF1 protein in THP-1 cells transfected with si-YTHDF2 and control; C.relative expression of MZF1 in AML compared to normal controls; *P<0.05 compared with normal controls

作為RNA功能重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)方式，m6A甲基化和其他RNA修飾一樣，可廣泛參與RNA穩(wěn)定性、RNA轉(zhuǎn)運、RNA二級結(jié)構(gòu)、RNA翻譯的調(diào)節(jié)[9-10]。尤其是最近相關(guān)研究技術(shù)的進步，為系統(tǒng)探索m6A在生理、病理過程中的功能和意義提供了可能。而解析m6A修飾相關(guān)蛋白的功能則是深入了解這種修飾調(diào)控意義的第一步。m6A修飾的“閱讀器”YTHDF2可以以類似癌基因的方式參與AML的發(fā)生發(fā)展；YTHDF2 mRNA在AML患者外周血中表達顯著上調(diào)，也提示其作為AML疾病臨床早期診斷的潛在應用價值。而YTHDF2作為m6A甲基化的特異性“閱讀器”，可以通過對這些位點的識別進而發(fā)揮下游調(diào)控作用[6]。后續(xù)的分子機制研究揭示出YTHDF2可通過調(diào)節(jié)靶基因MZF1 mRNA的穩(wěn)定性而靶向抑制MZF1的表達，為其臨床應用提供進一步的理論基礎(chǔ)。