硬膜外分娩鎮(zhèn)痛下產(chǎn)間發(fā)熱產(chǎn)婦血中IL-6水平升高

王一男，徐銘軍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 麻醉科， 北京 100026)

分娩疼痛是生理及心理相互交織的過程，過度疼痛對(duì)母胎都會(huì)造成不良影響。隨著社會(huì)的進(jìn)步和麻醉技術(shù)的發(fā)展，分娩鎮(zhèn)痛已被越來越多的孕產(chǎn)婦認(rèn)識(shí)和接受。椎管內(nèi)阻滯是目前最有效且對(duì)母嬰影響最小的分娩鎮(zhèn)痛方式。椎管內(nèi)阻滯包括硬膜外阻滯、蛛網(wǎng)膜下腔阻滯和腰麻-硬膜外聯(lián)合阻滯(combined spinal-epidural analgesia, CSE)[1-2]。雖然硬膜外阻滯分娩鎮(zhèn)痛技術(shù)對(duì)減輕產(chǎn)婦分娩疼痛、降低剖宮產(chǎn)率起到了重要作用，但臨床實(shí)施過程中，發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)婦伴隨產(chǎn)間發(fā)熱現(xiàn)象[3-4]。這種由鎮(zhèn)痛導(dǎo)致的發(fā)熱已排除感染因素，但具體的變化機(jī)制仍不明確。已有研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)痛后伴隨產(chǎn)間發(fā)熱的產(chǎn)婦血清中的炎性因子水平如IL-6顯著升高，因此推測硬膜外鎮(zhèn)痛的實(shí)施，激活了高炎性反應(yīng)狀態(tài)，導(dǎo)致體溫升高[5-7]。

MicroRNA(miRNA)是炎性免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子之一，特定的miRNA如miR-146b、miR-124和miR-21已被證實(shí)與多種炎性調(diào)節(jié)通路關(guān)系密切[8-9]。本研究通過考察miR-146b、miR-124和miR-21在鎮(zhèn)痛后發(fā)熱、鎮(zhèn)痛后不發(fā)熱、以及未實(shí)施鎮(zhèn)痛3組產(chǎn)婦外周血和臍帶血中的表達(dá)水平差異，尋找可能參與和介導(dǎo)分娩鎮(zhèn)痛所致產(chǎn)間發(fā)熱的miRNA分子。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 產(chǎn)婦外周血和臍帶血樣本：選取2017年1月至2017年10月北京市婦產(chǎn)醫(yī)院經(jīng)產(chǎn)房待產(chǎn)產(chǎn)婦，單胎頭位，無陰道分娩禁忌，均自愿接受實(shí)施硬膜外分娩鎮(zhèn)痛。其中產(chǎn)間監(jiān)測體溫超過37.5 ℃為鎮(zhèn)痛發(fā)熱組(fever，30例)。產(chǎn)間監(jiān)測體溫不超過37.5 ℃為鎮(zhèn)痛不發(fā)熱組(nonfever，30例)。隨機(jī)選取同期體溫正常產(chǎn)婦為對(duì)照組(control，30例)。3組年齡及孕周無差異。本項(xiàng)目所涉及臨床樣本的獲取已獲得北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)，免除知情同意。

1.1.2 293T細(xì)胞系：人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.1.3 試劑：DMEN高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)，血small RNA提取試劑盒(Qiagen公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒、Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)，合成小干擾RNA(siRNA)分子(廣州銳博科技生物有限公司)，兔抗Stat3單克隆抗體、小鼠抗GAPDH單克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理：分別收集fever組、nonfever組和對(duì)照組各30例樣本的外周血和臍帶血。室溫4 000 r/min 離心5 min，分離血清備用。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測miRNA的表達(dá)：按說明書操作，使用血清small RNA提取試劑盒提取血清中的miRNA。按說明書用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR檢測miRNA的引物如表1。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量 PCR所用引物列表Table 1 Quantitative RT-PCR primers for miRNA

1.2.3 miRNA mimic轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d，計(jì)數(shù)2×105個(gè)293T細(xì)胞鋪于6孔板中，培養(yǎng)過夜，使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，按照100 pmol/孔進(jìn)行miRNA mimic及對(duì)照組的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作4 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基，按照不同時(shí)間點(diǎn)收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.2.4 雙熒光報(bào)告基因檢測miRNA對(duì)IL-6的調(diào)控作用：構(gòu)建含有IL-6基因3′-UTR區(qū)的報(bào)告基因重組質(zhì)粒：以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用特異性擴(kuò)增IL-6基因3′-UTR區(qū)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分別酶切純化后的IL-6基因3′-UTR片段和pmiR-reporter質(zhì)粒。酶切后的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和回收純化，使用DNA連接酶過夜連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，挑取克隆并經(jīng)菌液PCR鑒定，測序驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒。

轉(zhuǎn)染前1 d，于24孔板中，每孔接種5×104個(gè)293T細(xì)胞，使用Lipo2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染：25 pmol miR-146b mimic或mimic control、300 ng pmiR-IL-6質(zhì)粒和30 ng pGL-3，37 ℃、5%CO2，轉(zhuǎn)染操作4 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測：首先將細(xì)胞充分裂解，10 000 r/min離心5 min；取上清進(jìn)行檢測；以pmiR-reporter/ pGL-3比值計(jì)算相對(duì)熒光報(bào)告基因活性。

1.2.5 Western blot檢測miRNA對(duì)Stat3表達(dá)的影響:收集293T細(xì)胞，以酶消化后，使用預(yù)冷的PBS洗滌2遍后，使用200 μL 蛋白裂解液裂解293T細(xì)胞， 冰浴30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清至新管。使用BCA蛋白定量試劑盒檢測提取蛋白質(zhì)的濃度。取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳；將凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，使用含5% BSA的TBST緩沖液洗膜，室溫振蕩封閉2 h；1∶4 000稀釋的抗Stat3抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后，加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；使用ECL試劑和自動(dòng)成像儀顯影和曝光。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，灰度掃描后顯示定量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IL-6水平在鎮(zhèn)痛發(fā)熱產(chǎn)婦外周血和臍帶血中均顯著升高

Fever組外周血及臍帶血中IL-6含量顯著升高(P<0.01)(圖1)。

2.2 miR-146b在鎮(zhèn)痛發(fā)熱產(chǎn)婦外周血和臍帶血中均顯著降低

miR-146b表達(dá)水平在Fever組外周血單個(gè)核細(xì)胞中以及外周血清中均顯著降低(P<0.01)(圖2A,B)。在臍帶血中miR-146b表達(dá)也降低(P<0.01)(圖2C，D)。

2.3 miR-146b靶向抑制IL-6的表達(dá)

293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-146b mimic可以顯著抑制帶有IL-6 3′-UTR報(bào)告基因的活性(圖3A, B)。

A.expression level of IL-6 in maternal blood; B.expression level of IL-6 in umbilical vein blood; *P<0.01 compared withcontrol group

A.relative expression of miR-146b, miR-124 and miR-21 in peripheral blood mononuclear cells; *P<0.01 compared with control group; B.relative expression of miR-146b, miR-124 and miR-21 in peripheral serum; *P<0.01 compared with control group; C.relative expression of miR-146b, miR-124 and miR-21 in cord blood mononuclear cells; *P<0.01 compared with control group; D.relative expression of miR-146b, miR-124 and miR-21 in cord blood serum； *P<0.01 compared with control group

A.sequence alignment of human miR-146b binding site in the IL-6 3′UTR; B.293T cells were transfected with luciferase reporter vector carrying either the wild type IL-6 3′UTR (IL-6 3′UTR-wt) or a mutated sequence (IL-6 3′UTR-mut) for the binding site of miR-146b, relative reporter activity was assessed at 48 hours post-transfection; *P<0.01 compared with control; C.secreted levels of IL-6 were determined by ELISA

與此相對(duì)應(yīng)地，分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-6水平也顯著降低(圖3C)。

2.4 miR-146b調(diào)節(jié)IL-6/Stat3信號(hào)通路

293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-146b mimic可以顯著抑制細(xì)胞內(nèi)Stat3的磷酸化水平(圖4)。

3 討論

疼痛是分娩過程中產(chǎn)生的一種復(fù)雜的生理和心

A.Western blot of p-Stat3 and total Stat3 in 293T cells transfected with miR-146b mimic or control; B.Quantitative analysis of Western blot results; *P<0.01 compared with control

理活動(dòng)綜合的結(jié)果，以疼痛級(jí)別高、持續(xù)時(shí)間長為特征，會(huì)對(duì)產(chǎn)婦和新生兒均造成不利影響。臨床上，針對(duì)性的應(yīng)對(duì)辦法是分娩鎮(zhèn)痛，即采用藥物使分娩時(shí)的疼痛減輕或消失，但實(shí)際實(shí)施過程中，發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)婦伴有發(fā)熱現(xiàn)象，但具體機(jī)制不明[1-4]。因此，鑒定參與分娩鎮(zhèn)痛所致發(fā)熱的可能調(diào)節(jié)因子，并闡明其作用機(jī)制是分娩鎮(zhèn)痛的研究熱點(diǎn)之一。miR-146b是炎性免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子之一，已有研究表明其可通過靶向抑制IL-1相關(guān)蛋白激酶1(inter-leukin 1 receptor associated kinase 1, IRAK1)和腫瘤壞死因子受體活化因子6(TRAF6)參與多種神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)[8-9]。本課題擬通過檢測鎮(zhèn)痛發(fā)熱產(chǎn)婦以及鎮(zhèn)痛不發(fā)熱和未鎮(zhèn)痛產(chǎn)婦外周血和臍帶血中miRNA的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)miR-146b在鎮(zhèn)痛發(fā)熱產(chǎn)婦中表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b可以靶向抑制重要的炎性因子IL-6的表達(dá)，并進(jìn)而對(duì)炎性通路IL-6/Stat3的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。以上結(jié)果提示，miR-146b有可能介導(dǎo)和參與了分娩鎮(zhèn)痛所致發(fā)熱的調(diào)節(jié)過程。