利用CRISPR/Cas9構(gòu)建R778L類型肝豆?fàn)詈俗冃约膊⌒∈竽Ｐ?/h1>
2018-12-14 00:44:18朱基彥瞿思遙張祝琴劉德培
基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床 2018年12期
朱基彥，瞿思遙，張祝琴，劉德培
(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 北京 100005)
肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticular degeneration，HLD)也稱Wilson’s disease(WD,威爾遜病)，是一類罕見的常染色體隱性遺傳的單基因疾病[1]。該病是由位于13號(hào)染色體上的ATP7B基因發(fā)生突變、插入或者缺失引起一類銅離子代謝障礙的疾病。ATP7B蛋白位于反式高爾基體(trans-Golgi network, TGN)膜上，具有將銅離子運(yùn)進(jìn)反式高爾基體中使其與銅藍(lán)蛋白相結(jié)合和將多余的銅離子運(yùn)入膽汁排泄出肝細(xì)胞的雙重功能[2]。目前，針對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃缘闹委熓侄沃饕锌刂骑嬍硿p少銅離子的攝取，利用銅離子螯合劑將淤積的銅排出體外和肝移植三種方法。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于基因敲除、疾病動(dòng)物模型的構(gòu)建和基因治療等領(lǐng)域中[3-4]。利用CRISPR/Cas9在基因組特定位點(diǎn)造成DNA雙鏈損傷斷裂，再利用機(jī)體DNA雙鏈損傷修復(fù)途徑實(shí)現(xiàn)基因敲除或者基因敲入。
肝豆?fàn)詈俗冃酝蛔冾愋捅姸?，在中?guó)等亞洲地區(qū)，最普遍的突變類型是R778L[5-6]。目前，應(yīng)用最廣泛的是ATP7B敲除小鼠，但是肝豆?fàn)詈俗冃跃哂懈叨犬愘|(zhì)性，針對(duì)R778L類型構(gòu)建相應(yīng)的點(diǎn)突變小鼠對(duì)于具體發(fā)病機(jī)制的研究十分必要。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞系：飼養(yǎng)層細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(由本課題組野生型C57BL/6小鼠或者DR4小鼠分離得到)。小鼠胚胎干細(xì)胞JM8A3(為本課題組保存)。
載體：CRISPR/Cas9的pX330載體[Addgene (Ad42230)]。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠和飼料：C57BL/6小鼠(SPF級(jí)別雄鼠)和小鼠專用飼料(北京維通利華公司)，單位合格證號(hào)：ACUC-A02-2016-013。
試劑和耗材：DMEM、Knock-DMEM、Opti-MEM、胎牛血清(Gibcobrl公司或者PAA公司)；青鏈霉素、β-巰基乙醇、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat.No: AM1344) 、NEAA、Glutamax-1(Invitrogen公司)；LIF(ESG1107)(Millipore公司)； DharmaFECT1(T-2001-03轉(zhuǎn)染試劑)(Thermo Fisher公司)；2i抑制劑(Selleck公司)；限制性內(nèi)切酶及T7E1(New England Biolabs公司)；RNeasy mini Kit (Qiagen公司)。
1.2 方法
1.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)：sgRNA利用CRISPR DESIGN(http://crispr.mit.edu/) 針對(duì)小鼠ATP7B的8號(hào)外顯子突變位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)6條sgRNA。同源重組模板設(shè)計(jì)見實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1.2.2 T7E Ⅰ酶切實(shí)驗(yàn)：使用高保真PCR體系對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行PCR，將得到的PCR產(chǎn)物純化回收，取500 ng PCR產(chǎn)物加入2 μL 10×NEB緩沖液2并用ddH2O補(bǔ)至20 μL后95 ℃變性5 min后自然冷卻至室溫。向退火產(chǎn)物中加入0.5 μL T7E1(5 U/μL)，37 ℃酶切30 min后，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析酶切結(jié)果。
1.2.3 體外轉(zhuǎn)錄guide RNA和Cas9 mRNA：分別用DraⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶線性化DNA模板后進(jìn)行酚氯仿抽提純化。使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。37℃轉(zhuǎn)錄2 h后加0.5 μL DNase 37 ℃消化DNA模板20 min。使用RNeasy mini Kit純化回收mRNA。
1.2.4 鼠受精卵顯微注射：供體鼠與正常雄鼠合籠，手術(shù)取出受精卵，加入M2中洗滌，置于M16培養(yǎng)基于5% CO2,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；挑選形態(tài)飽滿、透明帶清晰的受精卵進(jìn)行顯微注射，吸取注射后仍存活的受精卵，吹入假孕鼠輸卵管。
1.2.5 H&E染色：將石蠟切片放到 65 ℃ 烤片機(jī)上，烤片2 h。二甲苯脫蠟，水化，用蒸餾水洗去乙醇后用蘇木精染細(xì)胞核4 min。用自來(lái)水慢慢沖洗終止反應(yīng)，直至顏色變得發(fā)藍(lán)。將切片放到 0.1%鹽酸乙醇中70 s，用自來(lái)水洗 3～4遍，去除殘留的鹽酸。放入1%伊紅溶液中數(shù)分鐘，脫水，用二甲苯透明切片約 30 min。取出切片，待其風(fēng)干，使用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍照。
1.2.6 干的肝臟銅離子檢測(cè)：切取500 mg小鼠肝臟于1.5 mL離心管中，置于-20 ℃過(guò)夜冷凍。將樣品放入冷凍干燥儀中-48 ℃干燥，得到干燥的肝臟。將干燥的肝臟稱重并記錄。把肝臟用研磨器研磨成粉末，并用70%濃硝酸溶解(每50 mg樣品需加入500 μL 70%濃硝酸)。室溫溶解組織1 h后65 ℃繼續(xù)溶解4 h。用去離子水稀釋至3 mL。室溫，1 500 r/min離心5 min。取上清,利用原子吸收光譜法測(cè)銅離子濃度。
1.2.7 脫靶效應(yīng)的檢測(cè)和評(píng)估：針對(duì)on-target 位點(diǎn)和CRISPR design(http://crispr.mit.edu/)預(yù)測(cè)的top20 off-target位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，得到的PCR產(chǎn)物于Illumina PE150平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序。
2 結(jié)果
2.1 ATP7B在人和小鼠中是高度保守的
首先比對(duì)人和小鼠ATP7B序列的同源性，發(fā)現(xiàn)DNA序列和蛋白序列都是高度保守的。由于突變位點(diǎn)分別存在于人第778位氨基酸和小鼠第780位氨基酸，故用小鼠的R780L突變類型代表人R778L突變類型。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前針對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃越⒌膭?dòng)物模型物種中小鼠的使用頻率最高，應(yīng)用最廣泛(圖1)。
2.2 利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲入獲得R780L突變小鼠
采用CRISPR/Cas9聯(lián)合單鏈DNA介導(dǎo)的基因敲入實(shí)現(xiàn)精確的點(diǎn)突變。在8號(hào)外顯子突變位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)了6條sgRNA,通過(guò)T7E I酶切實(shí)驗(yàn)在小鼠ES細(xì)胞中篩選高效的sgRNA。最后通過(guò)顯微注射小鼠受精卵成功獲得攜帶目的點(diǎn)突變的小鼠(圖2)。
1,2.number of models圖1 小鼠是合適的肝豆?fàn)詈俗冃阅Ｐ蛣?dòng)物Fig 1 Mouse was suitable for establishing hepatolenticular degeneration model
圖2 利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯獲得R780L突變小鼠Fig 2 Using the CRISPR/Cas9-mediated gene editing to obtain R780L mutant mouse
2.3 R780L純合小鼠肝臟有明顯的病理改變
在沒有銅離子刺激情況下，8周的野生雄鼠、R780L雜合雄鼠和R780L純合雄鼠沒有明顯差異。當(dāng)進(jìn)行1 000 μmol/L CuSO4飲水從4周刺激到8周時(shí)，R780L純合小鼠出現(xiàn)明顯的肝臟組織結(jié)構(gòu)性破壞，失去嚴(yán)密性，并伴隨細(xì)胞核的增大。R780L雜合小鼠則無(wú)明顯差異(圖3)。
2.4 R780L純合小鼠肝臟有明顯的銅離子淤積且肝臟損傷明顯
在沒有銅離子誘導(dǎo)的情況下，R780L純合小鼠有顯著的銅淤積，雜合子則無(wú)此現(xiàn)象。加銅誘導(dǎo)后，R780L純合小鼠銅離子依然比野生型顯著升高，且加銅誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組，銅離子含量相當(dāng)。
加銅刺激組R780L純合小鼠ALT和AST含量均顯著升高。各組間的呼吸交換率沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖4)。
2.5 R780L突變純合模型鼠并未檢測(cè)到脫靶情況
在R780L純合小鼠中，并未檢測(cè)到脫靶情形，證明構(gòu)建的模型小鼠為R780L突變純合模型鼠(表1)。
3 討論
肝豆?fàn)詈俗冃跃哂懈叨犬愘|(zhì)性，R778L類型的突變是包括中國(guó)在內(nèi)的亞洲地區(qū)最為普遍的突變類型，但是其發(fā)病機(jī)制一直未被闡明。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次建立了針對(duì)人R778L類型肝豆?fàn)詈俗冃缘腞780L小鼠模型，并成功模擬出肝臟銅離子的淤積以及肝臟的病理病變，得出以下初步結(jié)論：小鼠是合適的肝豆?fàn)詈俗冃阅Ｐ臀锓N；利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以獲得R780L特異點(diǎn)突變的小鼠；R780L點(diǎn)突變純合小鼠有明顯的銅離子淤積以及肝臟損傷；R780L點(diǎn)突變模型小鼠是一種特異性突變的小鼠，沒有明顯脫靶效應(yīng)。所以R780L小鼠是研究R778L類型肝豆?fàn)詈俗冃园l(fā)病機(jī)制的理想模型。
目前肝豆?fàn)詈俗冃约膊?yīng)用最廣泛的模型是ATP7B knockout小鼠模型(以下簡(jiǎn)稱KO模型)[7]。
圖3 R780L突變鼠的H&E染色結(jié)果Fig 3 H&E staining results of R780L mutant mouse
*P<0.05 compared with WT+ and WT-; **P<0.001 compared with WT+ and WT-圖4 R780L純合小鼠肝臟有明顯的銅淤積并伴隨嚴(yán)重的肝臟損傷Fig 4 R780L homozygous mouse liver had obvious copper deposition accompanied by severe liver damage
KO鼠的優(yōu)點(diǎn)是能夠研究肝豆?fàn)詈俗冃园l(fā)病的共性問(wèn)題，能在最短的時(shí)間加深人們對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃缘睦斫猓遣荒芫_闡述不同突變類型各自的特點(diǎn)[2,8-10]，因此針對(duì)不同突變類型開發(fā)特定位點(diǎn)的動(dòng)物模型是未來(lái)闡述肝豆?fàn)詈俗冃愿?xì)發(fā)病機(jī)制的方向。
隨著CRISPR/Cas9為代表的高效基因編輯工具的出現(xiàn)，以及AAV病毒載體的發(fā)展，使得肝臟類單基因疾病有望通過(guò)基因治療的手段實(shí)現(xiàn)[11-13]。因此， R780L突變小鼠有望成為未來(lái)肝豆?fàn)詈俗冃曰蛑委煹睦硐胼d體。本研究也存在不足，目前只是在病理層面和分子層面模擬了R778L類肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床指標(biāo)，對(duì)于其具體的分子機(jī)制尚未闡述，有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證明。
表1 R780L純合突變小鼠脫靶效應(yīng)的檢測(cè)Table 1 Detection of off-target effects of R780L homozygous mutant mouse
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肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticular degeneration，HLD)也稱Wilson’s disease(WD,威爾遜病)，是一類罕見的常染色體隱性遺傳的單基因疾病[1]。該病是由位于13號(hào)染色體上的ATP7B基因發(fā)生突變、插入或者缺失引起一類銅離子代謝障礙的疾病。ATP7B蛋白位于反式高爾基體(trans-Golgi network, TGN)膜上，具有將銅離子運(yùn)進(jìn)反式高爾基體中使其與銅藍(lán)蛋白相結(jié)合和將多余的銅離子運(yùn)入膽汁排泄出肝細(xì)胞的雙重功能[2]。目前，針對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃缘闹委熓侄沃饕锌刂骑嬍硿p少銅離子的攝取，利用銅離子螯合劑將淤積的銅排出體外和肝移植三種方法。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于基因敲除、疾病動(dòng)物模型的構(gòu)建和基因治療等領(lǐng)域中[3-4]。利用CRISPR/Cas9在基因組特定位點(diǎn)造成DNA雙鏈損傷斷裂，再利用機(jī)體DNA雙鏈損傷修復(fù)途徑實(shí)現(xiàn)基因敲除或者基因敲入。
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1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞系：飼養(yǎng)層細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(由本課題組野生型C57BL/6小鼠或者DR4小鼠分離得到)。小鼠胚胎干細(xì)胞JM8A3(為本課題組保存)。
載體：CRISPR/Cas9的pX330載體[Addgene (Ad42230)]。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠和飼料：C57BL/6小鼠(SPF級(jí)別雄鼠)和小鼠專用飼料(北京維通利華公司)，單位合格證號(hào)：ACUC-A02-2016-013。
試劑和耗材：DMEM、Knock-DMEM、Opti-MEM、胎牛血清(Gibcobrl公司或者PAA公司)；青鏈霉素、β-巰基乙醇、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat.No: AM1344) 、NEAA、Glutamax-1(Invitrogen公司)；LIF(ESG1107)(Millipore公司)； DharmaFECT1(T-2001-03轉(zhuǎn)染試劑)(Thermo Fisher公司)；2i抑制劑(Selleck公司)；限制性內(nèi)切酶及T7E1(New England Biolabs公司)；RNeasy mini Kit (Qiagen公司)。
1.2 方法
1.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)：sgRNA利用CRISPR DESIGN(http://crispr.mit.edu/) 針對(duì)小鼠ATP7B的8號(hào)外顯子突變位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)6條sgRNA。同源重組模板設(shè)計(jì)見實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1.2.2 T7E Ⅰ酶切實(shí)驗(yàn)：使用高保真PCR體系對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行PCR，將得到的PCR產(chǎn)物純化回收，取500 ng PCR產(chǎn)物加入2 μL 10×NEB緩沖液2并用ddH2O補(bǔ)至20 μL后95 ℃變性5 min后自然冷卻至室溫。向退火產(chǎn)物中加入0.5 μL T7E1(5 U/μL)，37 ℃酶切30 min后，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析酶切結(jié)果。
1.2.3 體外轉(zhuǎn)錄guide RNA和Cas9 mRNA：分別用DraⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶線性化DNA模板后進(jìn)行酚氯仿抽提純化。使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。37℃轉(zhuǎn)錄2 h后加0.5 μL DNase 37 ℃消化DNA模板20 min。使用RNeasy mini Kit純化回收mRNA。
1.2.4 鼠受精卵顯微注射：供體鼠與正常雄鼠合籠，手術(shù)取出受精卵，加入M2中洗滌，置于M16培養(yǎng)基于5% CO2,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；挑選形態(tài)飽滿、透明帶清晰的受精卵進(jìn)行顯微注射，吸取注射后仍存活的受精卵，吹入假孕鼠輸卵管。
1.2.5 H&E染色：將石蠟切片放到 65 ℃ 烤片機(jī)上，烤片2 h。二甲苯脫蠟，水化，用蒸餾水洗去乙醇后用蘇木精染細(xì)胞核4 min。用自來(lái)水慢慢沖洗終止反應(yīng)，直至顏色變得發(fā)藍(lán)。將切片放到 0.1%鹽酸乙醇中70 s，用自來(lái)水洗 3～4遍，去除殘留的鹽酸。放入1%伊紅溶液中數(shù)分鐘，脫水，用二甲苯透明切片約 30 min。取出切片，待其風(fēng)干，使用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍照。
1.2.6 干的肝臟銅離子檢測(cè)：切取500 mg小鼠肝臟于1.5 mL離心管中，置于-20 ℃過(guò)夜冷凍。將樣品放入冷凍干燥儀中-48 ℃干燥，得到干燥的肝臟。將干燥的肝臟稱重并記錄。把肝臟用研磨器研磨成粉末，并用70%濃硝酸溶解(每50 mg樣品需加入500 μL 70%濃硝酸)。室溫溶解組織1 h后65 ℃繼續(xù)溶解4 h。用去離子水稀釋至3 mL。室溫，1 500 r/min離心5 min。取上清,利用原子吸收光譜法測(cè)銅離子濃度。
1.2.7 脫靶效應(yīng)的檢測(cè)和評(píng)估：針對(duì)on-target 位點(diǎn)和CRISPR design(http://crispr.mit.edu/)預(yù)測(cè)的top20 off-target位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，得到的PCR產(chǎn)物于Illumina PE150平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序。
2 結(jié)果
2.1 ATP7B在人和小鼠中是高度保守的
首先比對(duì)人和小鼠ATP7B序列的同源性，發(fā)現(xiàn)DNA序列和蛋白序列都是高度保守的。由于突變位點(diǎn)分別存在于人第778位氨基酸和小鼠第780位氨基酸，故用小鼠的R780L突變類型代表人R778L突變類型。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前針對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃越⒌膭?dòng)物模型物種中小鼠的使用頻率最高，應(yīng)用最廣泛(圖1)。
2.2 利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲入獲得R780L突變小鼠
采用CRISPR/Cas9聯(lián)合單鏈DNA介導(dǎo)的基因敲入實(shí)現(xiàn)精確的點(diǎn)突變。在8號(hào)外顯子突變位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)了6條sgRNA,通過(guò)T7E I酶切實(shí)驗(yàn)在小鼠ES細(xì)胞中篩選高效的sgRNA。最后通過(guò)顯微注射小鼠受精卵成功獲得攜帶目的點(diǎn)突變的小鼠(圖2)。
1,2.number of models圖1 小鼠是合適的肝豆?fàn)詈俗冃阅Ｐ蛣?dòng)物Fig 1 Mouse was suitable for establishing hepatolenticular degeneration model
圖2 利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯獲得R780L突變小鼠Fig 2 Using the CRISPR/Cas9-mediated gene editing to obtain R780L mutant mouse
2.3 R780L純合小鼠肝臟有明顯的病理改變
在沒有銅離子刺激情況下，8周的野生雄鼠、R780L雜合雄鼠和R780L純合雄鼠沒有明顯差異。當(dāng)進(jìn)行1 000 μmol/L CuSO4飲水從4周刺激到8周時(shí)，R780L純合小鼠出現(xiàn)明顯的肝臟組織結(jié)構(gòu)性破壞，失去嚴(yán)密性，并伴隨細(xì)胞核的增大。R780L雜合小鼠則無(wú)明顯差異(圖3)。
2.4 R780L純合小鼠肝臟有明顯的銅離子淤積且肝臟損傷明顯
在沒有銅離子誘導(dǎo)的情況下，R780L純合小鼠有顯著的銅淤積，雜合子則無(wú)此現(xiàn)象。加銅誘導(dǎo)后，R780L純合小鼠銅離子依然比野生型顯著升高，且加銅誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組，銅離子含量相當(dāng)。
加銅刺激組R780L純合小鼠ALT和AST含量均顯著升高。各組間的呼吸交換率沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖4)。
2.5 R780L突變純合模型鼠并未檢測(cè)到脫靶情況
在R780L純合小鼠中，并未檢測(cè)到脫靶情形，證明構(gòu)建的模型小鼠為R780L突變純合模型鼠(表1)。
3 討論
肝豆?fàn)詈俗冃跃哂懈叨犬愘|(zhì)性，R778L類型的突變是包括中國(guó)在內(nèi)的亞洲地區(qū)最為普遍的突變類型，但是其發(fā)病機(jī)制一直未被闡明。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次建立了針對(duì)人R778L類型肝豆?fàn)詈俗冃缘腞780L小鼠模型，并成功模擬出肝臟銅離子的淤積以及肝臟的病理病變，得出以下初步結(jié)論：小鼠是合適的肝豆?fàn)詈俗冃阅Ｐ臀锓N；利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以獲得R780L特異點(diǎn)突變的小鼠；R780L點(diǎn)突變純合小鼠有明顯的銅離子淤積以及肝臟損傷；R780L點(diǎn)突變模型小鼠是一種特異性突變的小鼠，沒有明顯脫靶效應(yīng)。所以R780L小鼠是研究R778L類型肝豆?fàn)詈俗冃园l(fā)病機(jī)制的理想模型。
目前肝豆?fàn)詈俗冃约膊?yīng)用最廣泛的模型是ATP7B knockout小鼠模型(以下簡(jiǎn)稱KO模型)[7]。
圖3 R780L突變鼠的H&E染色結(jié)果Fig 3 H&E staining results of R780L mutant mouse
*P<0.05 compared with WT+ and WT-; **P<0.001 compared with WT+ and WT-圖4 R780L純合小鼠肝臟有明顯的銅淤積并伴隨嚴(yán)重的肝臟損傷Fig 4 R780L homozygous mouse liver had obvious copper deposition accompanied by severe liver damage
KO鼠的優(yōu)點(diǎn)是能夠研究肝豆?fàn)詈俗冃园l(fā)病的共性問(wèn)題，能在最短的時(shí)間加深人們對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃缘睦斫猓遣荒芫_闡述不同突變類型各自的特點(diǎn)[2,8-10]，因此針對(duì)不同突變類型開發(fā)特定位點(diǎn)的動(dòng)物模型是未來(lái)闡述肝豆?fàn)詈俗冃愿?xì)發(fā)病機(jī)制的方向。
隨著CRISPR/Cas9為代表的高效基因編輯工具的出現(xiàn)，以及AAV病毒載體的發(fā)展，使得肝臟類單基因疾病有望通過(guò)基因治療的手段實(shí)現(xiàn)[11-13]。因此， R780L突變小鼠有望成為未來(lái)肝豆?fàn)詈俗冃曰蛑委煹睦硐胼d體。本研究也存在不足，目前只是在病理層面和分子層面模擬了R778L類肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床指標(biāo)，對(duì)于其具體的分子機(jī)制尚未闡述，有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證明。
表1 R780L純合突變小鼠脫靶效應(yīng)的檢測(cè)Table 1 Detection of off-target effects of R780L homozygous mutant mouse
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