梗阻性和非梗阻性無精子癥患者睪丸組織來源iPSCs系的建立

郭飛翔，付 欣，陳嘉欣，馬征來，張 文，安 庚*，范 勇*

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1.廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 2.生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 510150)

不育癥在普通人群中的發(fā)病率約為10%，男、女方因素各占50%。在不育男性中，無精子癥是最為嚴(yán)重的類型，發(fā)病率約為10%～15%，其主要分為兩種類型：40%為梗阻性無精子癥(obstructive azoospermia,OA)，60%為非梗阻性無精子癥(non-obstructive azoospermia,NOA)[1]。梗阻性無精子癥是指射精通道中任何區(qū)域的梗阻導(dǎo)致的精子排出障礙，非梗阻性無精子癥主要包括睪丸本身發(fā)育異常、藥物及放療等導(dǎo)致的精子生成障礙。近年來，隨著輔助生殖技術(shù)的提高，特別是卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，梗阻性無精子癥患者大都能如愿獲得自己的小孩，但非梗阻性無精子癥患者中仍有近半數(shù)的患者無法找到精子，只能選擇供精[2]。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的出現(xiàn)為這部分沒有獲取精子的患者提供了新的希望，本研究旨在用無精子癥患者自身的睪丸組織建立iPSCs系，并且對(duì)比OA患者和特發(fā)性NOA患者的建系過程有無區(qū)別。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 組織:收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2017年10月3例OA患者和3例特發(fā)性NOA患者的睪丸組織，分別在睪丸組織活檢術(shù)(testicular sperm extraction, TESE)和睪丸顯微取精術(shù)(micro-TESE)中取5～6 mm3的曲細(xì)精管組織作原代培養(yǎng)。該研究獲得廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院科學(xué)研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑:DMEM/F12(1∶1)、penicillin-streptomycin(雙抗)、kockout-DMEM、kockout-serum replacement(KSR)、glutamax(谷氨酰胺)、non-essential amino acids(非必需氨基酸)、bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、beta-mercaptoethanol(β-巰基乙醇)、0.05% trypsin/EDTA(胰蛋白酶)及EDTA(乙二胺四乙酸)(Gibco公司)，F(xiàn)BS(胎牛血清)(HyClone公司)，一抗：兔抗人SOX2單克隆抗體、兔抗人OCT4單克隆抗體、小鼠抗人TRA-1-60單克隆抗體、小鼠抗人SEEA-4單克隆抗體，二抗：FITC偶聯(lián)的山羊抗兔IgG和FITC偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgM (Abcam公司)；堿性磷酸酶(AP)染色液(武漢博士德生物工程有限公司)；仙臺(tái)病毒重編程試劑盒(Invitrogen 公司)；mTeSRTM1和 Matrix膠(Stem Cell Technology公司)。6只無特定病原體(SPF)級(jí)6～8周齡雄性嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠,體質(zhì)量18～21 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SCXK(京)2016-0011]。

1.2 方法

1.2.1 睪丸組織原代培養(yǎng)：將TESE和micro-TESE術(shù)中取到的睪丸組織迅速轉(zhuǎn)移至無菌實(shí)驗(yàn)室。超凈臺(tái)中準(zhǔn)備3個(gè)6 cm的培養(yǎng)皿，分別加入4 mL 2% PS(雙抗)的PBS緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液)，將睪丸組織在3個(gè)培養(yǎng)皿中依次清洗；再轉(zhuǎn)移至盛有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的(89% DMEM/F12+10% FBS+1% PS)3.5 cm培養(yǎng)皿中，用兩把顯微鑷的尖端將曲細(xì)精管組織研磨至碎片狀，再轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 r/min離心3 min；輕輕吸棄上清，加入30 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸組織沉淀，再將組織碎片重懸液均勻鋪種于4孔板中，使培養(yǎng)基正好蓋過組織碎片又不至于漂??；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天換液，根據(jù)細(xì)胞增殖量適當(dāng)添加培養(yǎng)基的用量。

1.2.2 iPSCs系的建立：睪丸組織原代細(xì)胞P2代細(xì)胞增殖滿后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞總量，取1.5×105個(gè)細(xì)胞量種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，第2天觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。病毒操作均在二級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，先將仙臺(tái)病毒液置于冰上融化，準(zhǔn)備15 mL離心管，加入2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再加入仙臺(tái)病毒液，混勻，2 250 r/min離心30 min。吸棄舊培養(yǎng)基，各加入1 mL新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再將離心后的病毒和培養(yǎng)基混液各1 mL加入到培養(yǎng)皿中。24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，每天換液。待轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖滿后再轉(zhuǎn)移至種有feeder(飼養(yǎng)層細(xì)胞)的10 cm培養(yǎng)皿中。D0繼續(xù)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，D1開始換用iPSCs培養(yǎng)基(77% KO-DMEM +20% KSR+1% Glu+1% NEAA+1% PS+bFGF+β-巰基乙醇)，每天換液。第21～22天挑取iPSCs克隆后，換用mTeSRTM1培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，適時(shí)機(jī)械切割法去除分化克隆。

1.2.3 iPSCs系的多能性鑒定

1.2.3.1 AP染色：準(zhǔn)備30%～40%密度的iPSCs細(xì)胞(3.5 cm培養(yǎng)皿)，吸棄舊培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入1 mL 4%多聚甲醛固定1 min；吸棄固定液，PBS清洗3次，加入1 mL新鮮配制的AP染色工作液,室溫避光放置30 min；吸棄染色液，PBS清洗1次，再加入PBS溶液，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.3.2 免疫熒光：將iPSCs傳至4孔板，待細(xì)胞增殖至3～4 d，吸棄培養(yǎng)基，用PBS將細(xì)胞清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min；用PBS清洗3次，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)室溫透膜1 h；吸棄透膜液，用PBS清洗3次，用2%的牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h；分別加一抗4 ℃孵育過夜；吸去一抗，用PBS清洗3次，分別加二抗37 ℃恒溫箱內(nèi)避光染色1 h；吸去二抗，用PBS清洗3遍，然后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核10 min；吸棄DAPI,用PBS清洗1次，再加入PBS溶液，置于共聚焦顯微鏡下成像觀察。

1.2.3.3 畸胎瘤實(shí)驗(yàn): 選擇第4～5天的iPSCs，用EDTA將細(xì)胞消化后，分別收集約1×107的單細(xì)胞懸液，注射到6周齡雄性SCID小鼠的腹股溝皮下，10～11周后取出瘤塊，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察三胚層。具體步驟參照本團(tuán)隊(duì)之前的文獻(xiàn)[3]。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)

組織培養(yǎng)第2天觀察到組織碎片貼于4孔板底部，第3天組織邊緣開始出現(xiàn)增殖的細(xì)胞，第9～10天達(dá)到增殖高峰，第13～14天增殖滿(圖1)。

A and B show cells in day 14 of OA and NOA patients, respectively; C and d show cells in day 3 passage 1 of OA and NOA patients, respectively 圖1 睪丸組織的原代培養(yǎng)Fig 1 Primary culture of tetis tissue(scale=200 μm)

2.2 iPSCs建系

轉(zhuǎn)染仙臺(tái)病毒后的睪丸組織細(xì)胞狀態(tài)良好，3～4天后皿底增殖滿細(xì)胞，胰蛋白酶消化傳代，鋪種于feeder上。第10天可見明顯的iPS細(xì)胞克隆團(tuán)，根據(jù)克隆的增殖狀態(tài)在第21～22天采用機(jī)械切割法挑取克隆至4孔板(圖2)。經(jīng)過3～4次傳代培養(yǎng)后，iPS克隆保持未分化的狀態(tài)增殖，排列緊密，狀態(tài)良好。

圖2 OA患者和NOA患者feeder上的iPS克隆長(zhǎng)至 第21天Fig 2 iPS clones on feeders in day 21 of OA and NOA patients, respectively(scale=100 μm)

圖3 OA患者和NOA患者iPSCs細(xì)胞AP染色陽(yáng)性Fig 3 Positive AP staining in iPSCs cells of OA and NOA patients, respectively(scale=100 μm)

2.3 iPSCs系的多能性鑒定

iPSCs克隆傳至第3代做AP染色和免疫熒光染色，分別鑒定所獲得的iPSCs系的分化狀態(tài)及其多能性。兩株iPSCs系的AP染色均為陽(yáng)性(圖3)；OCT4、SOX2、SSEA-4、TRA-1-60的免疫熒光染色均為陽(yáng)性(圖4)。

2.4 iPSCs系的體內(nèi)分化能力鑒定

將iPSCs細(xì)胞懸液注射入裸鼠腹股溝皮下后，6～8周后可見畸胎瘤形成，10～11周畸胎瘤長(zhǎng)至1 cm3左右，畸胎瘤取出后，切片做HE染色，鏡下可見3個(gè)胚層(圖5)。

A and B show merge image with OCT4 and DAPI staining of testis-derived iPSCs in OA and NOA patients, respectively; C and D show merge image with SOX2 and DAPI staining; E and F show merge image with SSEA4 and DAPI staining; G and H show merge image with TRA-1-60 and DAPI staining

A and B show differentiatedectoderm of the testis-derived iPSCs in OA and NOA patients, respectively; C and D show differentiated mesoderm; E and F show differentiated endoderm圖5 體內(nèi)畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)Fig 5 Vivo teratoma formation(scale=50 μm)

3 討論

男性不育癥已經(jīng)成為一個(gè)全球性的公共健康問題，越來越多的男性受到不育問題的困擾，其中治療最困難的是NOA患者，主要臨床表現(xiàn)為睪丸體積偏小，高卵泡刺激素水平(FSH)，并伴有嚴(yán)重的生精功能障礙。目前這些患者最主要的治療方法是睪丸顯微取精術(shù)(micro-TESE)結(jié)合卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)的治療，其總體取精率約為60%，一次妊娠率約為45%，治療結(jié)局依然不夠理想[2]。為了更好的幫助這部分患者，臨床上還需要制定更有效的治療方案來幫助NOA患者，近年來，iPS細(xì)胞的出現(xiàn)及其在體外分化為精子的研究給NOA患者提供了新的希望。

近年來，有關(guān)小鼠生殖細(xì)胞系的諸多研究，為 iPSCs細(xì)胞體內(nèi)和體外發(fā)育成雄性生殖細(xì)胞提供了理論基礎(chǔ)[4-6]。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞，無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ESC都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞類型。鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(miPSCs)類似于鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)，也能獲得原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(PGCLC)，可以在體內(nèi)分化為精子，并且通過ICSI技術(shù)產(chǎn)生健康的小鼠后代[7]。相比與miPSCs的naive狀態(tài)，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)的primed狀態(tài)誘導(dǎo)成男性生殖細(xì)胞的潛能相對(duì)要小，誘導(dǎo)分化成生殖細(xì)胞的難度也更大。目前，各個(gè)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)嘗試了多種方法研究hiPSCs誘導(dǎo)成男性生殖細(xì)胞，包括自發(fā)分化、生殖細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的過表達(dá)、細(xì)胞因子的添加、性腺細(xì)胞體外共培養(yǎng)及異種移植等[8-10]。

先前已有用皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞及外周血細(xì)胞建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的成功報(bào)道[11-13]，本研究選擇與精子發(fā)生直接相關(guān)的睪丸組織，取OA患者和特發(fā)性NOA患者的睪丸組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，結(jié)合仙臺(tái)病毒非基因整合方法成功建立了兩株無精子癥iPSCs系。兩株iPSCs系的AP染色均為陽(yáng)性；表達(dá)人干細(xì)胞多能性標(biāo)志蛋白OCT4、SOX2、SSEA-4、TRA-1-60；小鼠畸胎瘤實(shí)驗(yàn)也顯示獲得的iPSCs系能夠形成含三胚層的細(xì)胞，證明了無精子癥睪丸組織來源的iPSCs細(xì)胞具有多能性和高分化潛能。對(duì)OA患者和特發(fā)性NOA患者的睪丸組織基本建系過程進(jìn)行了比較，從原代培養(yǎng)到iPSCs細(xì)胞的克隆形成及iPSCs細(xì)胞系的穩(wěn)定性均沒有明顯差異，說明特發(fā)性NOA患者雖然生精障礙的原因暫不明確，但同OA患者一樣，睪丸組織能夠通過現(xiàn)有建系方法獲得iPSCs系。隨著精子發(fā)生機(jī)制和iPSCs細(xì)胞的研究進(jìn)一步深入，hiPSCs在生殖領(lǐng)域和治療男性不育方面的應(yīng)用依然具有巨大的潛力，為臨床工作提供了新的治療策略，更為NOA患者產(chǎn)生健康后代提供了可能性。