彝藥恒古骨傷愈合劑緩解去勢(shì)樹(shù)鼩骨質(zhì)疏松癥

角建林，唐 薇, 鄭 紅，趙宏斌*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部, 云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急診科，云南 昆明 650500)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見(jiàn)的中老年骨代謝疾病，臨床上特別多見(jiàn)于絕經(jīng)后女性[1]。OP的特點(diǎn)是骨含量減少和(或)骨組織結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體骨強(qiáng)度降低，骨脆性增加，以及引起的全身性骨折[2]。近年來(lái)隨著全球人口老齡化趨勢(shì)的發(fā)展，OP在全世界發(fā)病率逐年上升。臨床上治療OP時(shí)最常用的是鈣劑、激素代替劑(如雌二醇等)、雌激素受體激活劑、二膦酸鹽類(如利塞膦酸)和維生素D等，不僅價(jià)格昂貴且治療效果也不甚理想，除此之外，上述藥劑的長(zhǎng)期大量使用可能會(huì)使乳腺癌以及心腦血管疾病的發(fā)病率升高[3- 5]。近幾年報(bào)道，大量中藥如淫羊藿、 陳皮、 葛根和左歸丸等天然產(chǎn)物治療OP，源自于中國(guó)云南省彝族南部的古方——滇產(chǎn)彝藥恒古骨傷愈合劑(osteoking，OK)，其主要功能為活血益氣、接骨續(xù)筋、補(bǔ)肝腎和消腫止痛等，顯示有一定的療效[6]。已證實(shí)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和核因子 κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)與絕經(jīng)后OP的發(fā)生有密切關(guān)系[7]。本實(shí)驗(yàn)探討OK防治OP的細(xì)胞因子途徑，為今后臨床OP的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑： 恒古骨傷愈合劑(云南克雷斯天然藥物制藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025103號(hào)，由三七、黃芪、人參、紅花、杜仲、鱉甲、陳皮等配方制成，生藥含量為 0.36 g/mL)；雌激素片(新疆新姿源生物制藥有限責(zé)任公司)；雌二醇(E2)、血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)以及骨鈣素(bone glaprotein, BGP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.2 動(dòng)物: 48只12月齡雌性滇西亞種樹(shù)鼩，體質(zhì)量為100～120 g[昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滇)K2013- 0002]。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥： 將樹(shù)鼩隨機(jī)分為正常組(n=8)和去除兩側(cè)卵巢OP模型樹(shù)鼩(樹(shù)鼩全身骨密度檢測(cè)下降25%，n=8)。恒古骨傷愈合劑低 (OK-L,n=8)、中 (OK-M,n=8)和高 (OK-H,n=8)治療組分別給予0.5、1.5和3.0 mL/d OK灌胃治療，陽(yáng)性藥物對(duì)照組(n=8)給予OK 1.5 mL/d結(jié)合雌激素灌胃治療，10周后處死樹(shù)鼩。

1.2.2 標(biāo)本的收集： 收集尿液，心臟采血，分離血清，取下右側(cè)下肢，鈍性分離，剝離干凈皮膚和肌肉組織，將骨頭用0.9% NaCl溶液洗凈后，置于液氮中速凍，取出溶解，如此重復(fù)3次后，研磨成粉漿狀存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生化指標(biāo)的檢測(cè)： 用ELISA試劑盒測(cè)定血清中E2、ALP和BGP的含量，按照試劑盒說(shuō)明用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血鈣(S-Ca)、血磷(S-P)、尿鈣(U-Ca)和尿磷(U-P)的含量。

1.2.4 骨密度(BMD)的檢測(cè)： 拉直脊柱后行雙能射線 DXA測(cè)定骨密度。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(RT-qPCR)檢測(cè)OPG、RANKL和RUNX2的mRNA：取右下肢骨組織，經(jīng)液氮速凍和反復(fù)研磨好的骨組織約100 mg，超聲粉碎，用Trizol提取總RNA，定量后反轉(zhuǎn)錄為隨機(jī) cDNA，加入引物以及熒光染料進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，退火60 ℃ 30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)次數(shù)40次，最后72 ℃再延伸5 min。結(jié)果采用RT-q PCR 相對(duì)擴(kuò)增分析法 2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。具體引物見(jiàn)表1。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)OPG、RANKL和RUNX2的蛋白： 取出研磨好的骨組織約1 g，加入RIPA組織裂解液和PMSF勻漿，蛋白定量后沸水浴約15 min，每個(gè)樣品取50 μg進(jìn)行SDS凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗4 ℃過(guò)夜，二抗孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑 ECL顯色，曝光，以β-actin作為內(nèi)參，掃描圖像，用Image J軟件計(jì)算各條帶的吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OK對(duì)OP樹(shù)鼩生化指標(biāo)的影響

與正常組比較， 模型組樹(shù)鼩血清鈣、磷的含量降低(P<0.05)，尿液中鈣、磷的含量升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組樹(shù)鼩血清鈣、磷含量均不同程度地升高，尿液中鈣、磷的含量不同程度降低，OK治療組療效呈現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.05)(表2)。

2.2 OK對(duì)OP樹(shù)鼩體質(zhì)量和E2的影響

與正常組比較，去除卵巢后的OP模型組樹(shù)鼩體質(zhì)量升高明顯 (P<0.05)，模型組樹(shù)鼩E2含量下降明顯 (P<0.05)，經(jīng)OK灌胃治療后，E2含量逐漸升高，呈劑量依賴性(表3)。

2.3 OK對(duì)OP樹(shù)鼩骨生成標(biāo)志物的影響

與正常組比較，模型組ALP的含量降低(P<0.05)，BGP水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組血清中ALP水平有所增加(P<0.05)，OK低、中、高劑量治療組ALP含量增加(P<0.05), BGP 顯著降低(P<0.05) (表4)。

2.4 OK對(duì)OP樹(shù)鼩BMD的影響

OP組樹(shù)鼩全身骨密度(BMD)較正常組明顯降低(P<0.05)，經(jīng)OK灌胃治療10周后，隨OK劑量的增加，治療效果更加明顯 (圖1)。

2.5 OK對(duì)OP樹(shù)鼩OPG、RUNX2和RANKL mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組中OPG、RUNX2的mRNA水平下降 (P<0.05)，RANKL的mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)。與模型組比較， 陽(yáng)性對(duì)照組和OK治療組OPG、RUNX2的mRNA水平都有所增加，RANKL的mRNA表達(dá)水平下降，其中OK中、高劑量組有顯著差異(P<0.05)(圖2)。

表2 各組樹(shù)鼩血清和尿液中鈣、磷含量比較Table 2 Concentration of calcium and phosphorus in serum and urine in each mmol/L, n=8)

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with model.

表3 各組樹(shù)鼩體質(zhì)量和E2含量比較

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with model.

表4 各組樹(shù)鼩ALP和BGP含量比較

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with model.

*P<0.05 compared with control； #P<0.05 compared with model圖1 各組樹(shù)鼩全身骨密度比較Fig 1 Comparation of BMD in tree shrews of each

2.6 OK對(duì)OP樹(shù)鼩OPG、RUNX2和RANKL蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組中 OPG、RUNX2的蛋白水平下降 (P<0.05)，RANKL的蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和OK治療組OPG、RUNX2的蛋白水平都有所增加，RANKL的蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05) (圖3)。

3 討論

隨著中國(guó)逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì)的步伐， OP成為嚴(yán)重威脅著絕經(jīng)期婦女和老年人生活質(zhì)量的常見(jiàn)疾病，已引起廣泛重視[8]。雌激素有增加骨含量、提高骨密度的作用，并且能夠促進(jìn)鈣質(zhì)吸收和骨骼生長(zhǎng)[9]。據(jù)報(bào)道，在卵巢切除大鼠中，模型大鼠骨質(zhì)減少、骨密度降低表現(xiàn)出與人類OP較高的相似度，因此，切除雙側(cè)卵巢是OP較為理想的動(dòng)物模型構(gòu)建手段。在本次研究中，以與靈長(zhǎng)類親緣關(guān)系最為接近的樹(shù)鼩來(lái)創(chuàng)建卵巢摘除的OP模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OP模型組樹(shù)鼩血清中E2含量明顯下降，全身骨密度(BMD)下降(超過(guò)25%)，骨代謝相關(guān)的生化指標(biāo)也變化明顯，BGP、U-Ca和U-P的含量在OP組樹(shù)鼩中都顯著上升，ALP、S-Ca和S-P的含量顯著下降，說(shuō)明OP樹(shù)鼩模型構(gòu)建成功。

*P<0.05 compared with control； #P<0.05 compared with model圖2 各組樹(shù)鼩OPG、RUNX2和RANKL mRNA表達(dá)Fig 2 mRNA expression level of OPG, RUNX2 and RANKL in each n=8)

目前，臨床上治療OP的藥物雖有一定療效，但不良反應(yīng)大、 價(jià)格昂貴等因素成為OP治療的最大限制，因此天然中藥的開(kāi)發(fā)成為OP治療的新方向。中國(guó)云南彝族的民族特色藥物OK 由三七、黃芪、 紅花、 人參、鉆地風(fēng)、洋金花和杜仲等重要配方制成， 為治療骨折、 骨病等的內(nèi)服方藥[10]。骨形成和骨吸收之間就維持著動(dòng)態(tài)平衡， 最終導(dǎo)致骨量改變。已有文獻(xiàn)報(bào)道OK能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和成熟，并通過(guò)Wnt/β-catenin、 OPG/RANKL/RUNX2等信號(hào)通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，臨床上OK已用來(lái)治療OP后骨折的愈合。OK具有較強(qiáng)的雌激素樣作用[11]， 能促進(jìn)骨的鈣化和骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖，以及促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞合成堿性磷酸酶。另外OK可減少破骨細(xì)胞的形成， 抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能，以及誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗OP的作用。本研究中OP樹(shù)鼩在進(jìn)行OK灌胃治療后，E2含量明顯增加，ALP、BGP以及Ca、Mg等與骨形成相關(guān)的生化指標(biāo)也得到明顯改善。此外樹(shù)鼩在接受OK治療后，其骨組織中OPG的表達(dá)上調(diào)，而RANKL表達(dá)下降，進(jìn)而影響到OPG/RANKL比值，并且OK可作用于ERK通路，進(jìn)而影響RUNX2，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞的分化。來(lái)自我國(guó)云南彝族的民族特色藥物OK能夠通過(guò)增加E2分泌、抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成增加全身骨密度，可能對(duì)臨床OP的預(yù)防和治療有一定的作用。