膠原/HA復(fù)合涂層多孔鈦的細胞響應(yīng)行為

李若琳，張云龍，寇宏超，李仁興，盧雅琳

(1. 江蘇理工學(xué)院材料工程學(xué)院，江蘇 常州 213001)(2. 西北工業(yè)大學(xué) 凝固技術(shù)國家重點實驗室，陜西 西安 710072)

1 前 言

醫(yī)用鈦合金材料已成為骨科、齒科和心血管等植介入物或器械用主要原材料，但要滿足患者臨床治療的長效安全性和功能性，醫(yī)用鈦合金材料的生物及力學(xué)相容性仍有待提高[1]。鈦合金植入人體后會產(chǎn)生應(yīng)力屏蔽，在外力和體液的侵蝕下，表面的氧化物鈍化膜有可能出現(xiàn)剝離和溶解，因此在使用過程中會有物質(zhì)釋放到組織中，在生物體內(nèi)產(chǎn)生毒性、炎癥、血栓等反應(yīng)[2]，這些缺點嚴重影響了鈦合金人工關(guān)節(jié)的長期應(yīng)用效果[3]。為解決以上問題，研究人員采用了在鈦及鈦合金中引入孔隙并對其進行表面改性的方法[4]。多孔結(jié)構(gòu)可通過調(diào)控孔隙率使材料的彈性模量接近人骨而減少應(yīng)力屏蔽[5, 6]，且其獨特的三維連通孔能使體液和營養(yǎng)物質(zhì)在多孔植入體中傳輸，促進組織再生與重建，加快愈合過程。

人工植入材料的基本要求是不僅具有生物相容性，而且與相鄰宿主骨間存在生物活性[7, 8]。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是人體硬組織的基本無機成分，具有良好的生物相容性及生物活性[9, 10]，HA涂層的溶解刺激了骨組織的結(jié)合，它植入人體后能在短時間內(nèi)與人體的軟組織形成緊密結(jié)合[11]。在多孔鈦表面涂覆HA活性涂層，可改變原多孔鈦的表面形態(tài)，使其具有與人骨相近的鈣磷比，有利于成骨細胞的粘附、增殖和分化[12]。另一方面，水溶性膠原蛋白是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的骨架，并保留了自身生物活性，且膠原在細胞外基質(zhì)中形成半晶體的纖維，給細胞提供抗張力和彈性，并在細胞的遷移和發(fā)育中起作用[13, 14]。綜合以上研究結(jié)果，選取多孔鈦作為基體，在其表面涂覆膠原/HA復(fù)合涂層，有望使植入多孔鈦得到更好的細胞響應(yīng)，促進骨組織長入并形成生物固定。本文研究膠原/HA復(fù)合涂層的表面形貌及化學(xué)成分，探討復(fù)合涂層在多孔鈦上的形成機理，進行體外細胞毒性實驗并分析了多孔鈦表面細胞響應(yīng)行為。

2 實驗方法

鈦網(wǎng)層狀壓制燒結(jié)多孔鈦樣品[15]的直徑為16 mm、高4 mm，鈦網(wǎng)在使用前需在酒精、硝酸、氫氟酸體積比為1∶3∶7的混合溶液中浸泡以完成表面活化，然后在丙酮中超聲波清洗20 min。清洗后的樣品放入濃度為5.0 mol/L的NaOH溶液中，密封、60 ℃保溫處理24 h。取出后用去離子水清洗，空氣中干燥。處理后的樣品在630 ℃進行熱處理，熱處理時升溫速度為3 ℃/min，在630 ℃保溫1 h，隨爐冷卻。然后對樣品進行預(yù)鈣化處理：將樣品放入0.5 mol/L Na2HPO4溶液中24 h，再在飽和Ca(OH)2溶液中浸泡5 h。取出后用去離子水清洗，于36.5 ℃模擬體液(simulated body fluid，SBF，離子濃度見表1)中浸泡2周，取出后于空氣中干燥，進行高壓消毒滅菌(120 ℃、20 min)，消毒完成后進行干燥，即制備了HA涂層多孔鈦。將HA涂層多孔鈦完全浸入濃度為7 g/L的水溶性膠原溶液中5 h，完成膠原/HA復(fù)合涂層制備。浸泡過程中每48 h更換一次SBF，以(CH2OH)3CNH2溶液作為緩沖液，調(diào)節(jié)pH到7.25。

進行體外細胞毒性實驗時，選用小鼠前成骨細胞MC3T3-E1，采用直接接觸方式，首先將膠原/HA復(fù)合涂層多孔鈦在120 ℃、20 min高溫滅菌。以2×104的細胞密度種植于24孔板，連續(xù)培養(yǎng)5 d后，部分進行噻唑藍(MTT)比色法檢測，其余用乙醇進行細胞固定，用以觀察細胞響應(yīng)行為。

表1 模擬體液(SBF)和人體血清離子濃度對照(mmol/L)Table 1 Ion concentrations of simulated body fluid (SBF) and human blood plasma

采用TESCAN VEGA3掃描電鏡(SEM)及能譜分析儀(EDS)對膠原/HA復(fù)合涂層的表面形貌及化學(xué)成分進行分析，探討了膠原/HA復(fù)合涂層的形成機理，對改性前后多孔鈦表面的細胞響應(yīng)行為進行觀察。

3 結(jié)果與討論

對膠原/HA復(fù)合涂層多孔鈦表面進行打磨至其露出橫截面，SEM照片如圖1a所示，未打磨的樣品縱向表面SEM照片如圖1b所示，增大放大倍數(shù)至5000(圖1c)，觀察打磨后橫截面的膠原/HA復(fù)合涂層與多孔鈦基體結(jié)合程度。對比圖1a和1b可看到，打磨后的樣品表面由內(nèi)到外分為a、b、c、d 4層，表2為對這4個區(qū)域進行EDS測試后得到的各元素原子百分比，a層由內(nèi)向外為純鈦纖維基體及表面活化納米層，這種微孔結(jié)構(gòu)便于HA的形核，并且所形成的HA層與基體的結(jié)合力很強；b層由于其表面含有大量鈣元素及少量磷元素，推測b層為預(yù)鈣化層，預(yù)鈣化對HA有誘導(dǎo)沉積作用，進而可形成均勻涂層；c層鈣磷原子比達到1.7，滿足標準HA涂層鈣磷原子比1.67的要求，c層為HA涂層，使材料表面具有與人骨相近的鈣磷比，提高了材料的生物活性；d層含有大量的C,O元素，少量Ti元素，符合膠原蛋白組成，d層為膠原層，進一步提高了材料表面的生物活性；Ti元素的原子百分比由內(nèi)到外依次遞減。因此，多孔鈦表面由內(nèi)到外依次為：多孔鈦基體及表面活化納米層、預(yù)鈣化層、HA層和膠原層，實現(xiàn)了預(yù)定的多孔鈦表面功能化涂層的設(shè)計。

從圖1c中可看出，膠原/HA復(fù)合涂層的厚度約為3～5 μm，與多孔鈦基體結(jié)合良好。圖1d為HA涂層缺損處，膠原直接附著在堿熱處理形成的納米孔上的形貌，說明了即使涂層存在表面微裂紋等缺陷，膠原也可以起到補充加強多孔鈦生物相容性的作用。

圖1 多孔鈦表面膠原/HA復(fù)合涂層SEM照片：(a)橫截面，(b)縱截面，(c) 放大倍數(shù)下橫截面，(d) HA涂層缺損處Fig.1 SEM images of the collagen/hydroxyapatite composite coating: (a) cross section, (b) longitudinal surface, (c) magnified cross section, (d) HA coating defect

表2 多孔鈦表面復(fù)合涂層EDS所測元素的原子百分比Table 2 The atomic percents of elements of composite coating analyzed by EDS(at%)

膠原/HA復(fù)合涂層的形成機理如圖2所示，堿熱處理后多孔鈦表面形成非晶的鈦膠層，熱處理后表面形成鈦酸鈉，預(yù)鈣化過程中樣品表面的鈦酸鈉水解，形成帶負電的活性Ti—OH，Ca2+被靜電引力均勻吸附到表面的活性羥基位上。在浸泡SBF過程中，PO43-與Ca2+發(fā)生反應(yīng)，均勻附著在Ca2+表面，同時，又有Ca2+均勻吸附到PO43-表面，層層疊加吸附，形成了均勻分布的HA，隨后浸泡到膠原溶液中，表面沉積均勻的類人膠原層。

對不同方法處理后的樣品進行細胞培養(yǎng)5 d，后進行MTT檢測，對照組(control)為無多孔鈦的樣品孔，所得結(jié)果列于表3，各樣品孔中光密度(OD)值均小于對照組，且有顯著性差異。以control組細胞存活率為100%，表面活化、HA涂層及膠原/HA復(fù)合涂層上細胞存活率分別為8.07%、33.03%、45.68%?？梢钥吹娇扇苄阅z原的添加增加了細胞的成活率，提高了多孔鈦支架的生物相容性。由于基體為多孔材料，內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，胰酶不能將材料上附著的細胞全部消化下來，數(shù)據(jù)存在誤差，但可以參考其變化趨勢。

圖2 多孔鈦表面膠原/HA復(fù)合涂層形成機理示意圖Fig.2 The mechanism schematic of the collagen/hydroxyapatite composite coating on porous titanium

表3 不同表面處理狀態(tài)多孔鈦MTT檢測的光密度(OD)值Table 3 Optical density value of porous titanium samples with different surface conditions through MTT test

對不同方法處理后的樣品進行細胞培養(yǎng)5 d,后進行表面形貌觀察，圖3a為對照組孔洞中粘附的MC3T3-E1細胞的顯微照片，圖3b為表面活化后多孔鈦表面的SEM照片，圖3c為HA改性后多孔鈦表面的SEM照片，圖3d為膠原+HA改性后多孔鈦表面的SEM照片，通過對比發(fā)現(xiàn)，多孔鈦表面的陰影與對照組中粘附的MC3T3-E1細胞形態(tài)一致，并結(jié)合MTT測試結(jié)果，可斷定此陰影為多孔鈦表面粘附的MC3T3-E1細胞。細胞在表面活化后的多孔鈦表面可以粘附，但成骨細胞很難鋪展，生長緩慢。沉積HA可以有效提高細胞成活率，但是對比發(fā)現(xiàn)，膠原/HA復(fù)合涂層表面細胞增殖最多，更有利于成骨細胞的鋪展和生長，且在短時間內(nèi)實現(xiàn)多孔鈦纖維中跨絲生長，縮短成骨細胞跨纖維孔內(nèi)填充生長所需時間，加速骨愈合，與MTT檢測所得結(jié)果相互印證。

圖3 對照組中細胞培養(yǎng)5 d后的細胞形貌(a)及不同表面處理狀態(tài)多孔鈦樣品與細胞共培養(yǎng)5 d后的樣品表面照片： (b) 表面活化，(c) HA涂層，(d) 膠原/HA涂層Fig.3 The morphology of cells in control group after incubating for 5 days (a), surface morphologies of porous titanium samples with different surface conditions after cell incubated for 5 days: (b) surface activated, (c) HA coating, (d) collagen/HA coating

4 結(jié) 論

膠原/HA復(fù)合涂層在鈦纖維表面均勻附著，膠原的填充連接可修復(fù)HA涂層表面的微裂紋。膠原蛋白改性的HA表面有利于細胞附著，可提高小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的黏附、增殖及分化，促進細胞在孔內(nèi)跨纖維生長。復(fù)合涂層可以得到更好的細胞響應(yīng)，對于促進早期骨與植入體的固定有很大的幫助。