近紅外熒光染料在胃癌人源性腫瘤組織異種移植模型研究中的應(yīng)用

趙寧寧，張彩勤，趙勇，楊麗，張海，劉漪淪，師長宏*

（1.成都醫(yī)學(xué)院，成都 610500；2.第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

研究報(bào)告

近紅外熒光染料在胃癌人源性腫瘤組織異種移植模型研究中的應(yīng)用

趙寧寧1，2，張彩勤2，趙勇2，楊麗1，2，張海2，劉漪淪1，師長宏1，2*

（1.成都醫(yī)學(xué)院，成都 610500；2.第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

目的建立胃癌人源性腫瘤組織異種移植（patient-derived tumor xenograft，PDX)裸鼠模型，探討近紅外熒光（near infrared fluorescence，NIRF)染料IR-783在胃癌PDX模型活體成像研究中的應(yīng)用。方法取臨床胃癌新鮮手術(shù)切除標(biāo)本，裸鼠腎包膜移植建立PDX模型，HE染色比較移植腫瘤組織與患者腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的一致性。將移植腫瘤組織裸鼠皮下接種，20 d后，荷瘤小鼠腹腔注射NIRF染料IR-783（每只10 nmol/L)，活體成像連續(xù)測定腫瘤部位近紅外熒光強(qiáng)度并分析腫瘤體積與熒光強(qiáng)度的相關(guān)性；免疫組織化學(xué)檢測移植腫瘤組織中HIF1α與OATP1B3的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果成功建立了3個(gè)人胃癌PDX模型，移植腫瘤組織較好的保持了原發(fā)腫瘤的特征，NIRF活體成像早期檢測到腎包膜部位熒光信號。PDX模型中腫瘤體積與熒光強(qiáng)度的相關(guān)性均在98%以上。移植腫瘤組織中HIF1α與OATP1B3表達(dá)呈強(qiáng)陽性。結(jié)論NIRF染料IR-783可在PDX模型腫瘤部位特異性聚集，用于PDX模型的早期檢測，這種腫瘤靶向性可能與HIF1α和OATP1B3的表達(dá)相關(guān)。

人源性腫瘤組織異種移植模型；近紅外熒光染料；低氧誘導(dǎo)因子-1；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B3

將患者的新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠建立的異種荷瘤模型（patient-derived tumor xenograft，PDX)，較好的保留了原發(fā)腫瘤的微環(huán)境和基本特性，復(fù)制了患者腫瘤的異質(zhì)性，保持了人體原發(fā)腫瘤分子學(xué)，基因?qū)W和病理學(xué)的復(fù)雜性，為腫瘤研究提供了一個(gè)很好的體內(nèi)模型[1-3］。但該類模型制備影響因素較多，每個(gè)標(biāo)本需觀察2個(gè)月以上才能決定模型是否成功，本研究將近紅外熒光活體成像技術(shù)應(yīng)用于人胃癌標(biāo)本裸鼠腎包膜移植模型的早期影像學(xué)診斷[4、5］，并成功建立了3個(gè)胃癌的PDX模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本

6～7周齡SPF級BALB/c雄性裸鼠30只，體重20 g左右，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK（京)2012-0001】，飼養(yǎng)在第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級屏障系統(tǒng)中【SYXK（陜) 2014-001】。所有胃癌腫瘤標(biāo)本來自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病醫(yī)院，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過了第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)（編號14013)，所有人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)通過了西京醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（編號2015432)。

1.2 試劑

近紅外熒光（near infrared fluorescent，NIRF)染料IR-783由美國Cedars-Sinai Medical Center，Leland Chung教授提供，使用濃度為100μmol/L，水合氯醛濃度為7 g/100 mL，基質(zhì)膠（Matrigel Matrix)購自BD公司。HIF1α兔抗人單克隆抗體購自艾博抗體上海貿(mào)易有限公司，OATP1B3鼠抗人單克隆抗體購自Genetex公司。

1.3 人胃癌PDX模型的建立方法

臨床胃癌患者手術(shù)切除組織標(biāo)本離體后立即放入4℃培養(yǎng)基中，將組織分為兩部分，一部分4%多聚甲醛固定，另一部分切成1 mm×1 mm×3 mm的小塊與基質(zhì)膠混勻。將BALB/c裸鼠腹腔注射水合氯醛，麻醉劑量為5 mL/kg；從左側(cè)背部開1 cm左右切口，剪開肌肉層，把小鼠腎臟托出；在解剖顯微鏡下，使用眼科鑷子分離腎包膜，將混有基質(zhì)膠的腫瘤組織用玻璃彎頭輕輕送入腎包膜下；然后將腎臟送入腹腔，傷口對齊縫好，小鼠置于恒溫臺上，蘇醒后放入籠內(nèi)。每個(gè)腫瘤組織移植5只裸鼠。

1.4 NIRF活體成像檢測PDX模型的形成

移植6周后，裸鼠腹腔注射NIRF染料IR-783（100μmol/L)，劑量為100μL/20 g，24 h后在Caliper lumina II（美國Caliper公司)小動(dòng)物光學(xué)成像系統(tǒng)中進(jìn)行近紅外熒光活體成像（激發(fā)/發(fā)射:745 nm/ICG)，每5 d測量一次，腎臟部位具有明確熒光信號的小鼠為陽性小鼠。

1.5 PDX模型的穩(wěn)定傳代

持續(xù)觀察腎臟部位具有熒光信號的小鼠，直至腎臟部位具有明顯的隆起，水合氯醛麻醉處死小鼠，取腎臟部位生長的腫瘤組織，采用皮下移植的方法進(jìn)行傳代。將組織剪成2 mm×2 mm×3 mm的小塊與基質(zhì)膠1∶1混合，使用套管針注射于裸鼠后背部或腹股溝等3～4塊?；颊呓M織腎膜下移植生長的腫瘤稱為原代，首次皮下傳代為F1代，當(dāng)皮下傳至F3代時(shí)，取部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，HE染色并與患者腫瘤組織比較。凍存部分F3代腫瘤，作為以后研究使用。

1.6 PDX模型生長曲線

將F3代腫瘤組織切成2 mm×2 mm×3 mm的小塊，移植于裸鼠皮下，20 d后開始測量腫瘤體積，每5 d測量一次，測量至第40天。按下列公式計(jì)算瘤體積V=1/2×L（長)×W（寬)2，繪制腫瘤生長曲線。

1.7 NIRF強(qiáng)度與腫瘤大小的相關(guān)性

將F3代腫瘤組織切成2 mm×2 mm×3 mm的小塊裸鼠皮下移植，20 d后按照1.4的方法測量裸鼠皮下腫瘤的發(fā)光強(qiáng)度并獲得ROI（regions of interest)值。每5 d測量一次，測量至第40天。繪制熒光強(qiáng)度與腫瘤體積的相關(guān)性曲線。

1.8 PDX模型腫瘤組織病理形態(tài)和免疫組織化學(xué)分析

將患者腫瘤組織和裸鼠體內(nèi)傳至F3代的瘤組織用4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，組織切片并進(jìn)行HE染色，觀察組織病理變化，一抗分別為HIF1α兔抗人單克隆抗體和OATP1B3鼠抗人單克隆抗體，二抗分別為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠抗體。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的數(shù)據(jù)比較采用Student’s t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 胃癌PDX裸鼠模型的建立

本研究共移植5個(gè)臨床胃癌組織標(biāo)本，其中有3個(gè)標(biāo)本（樣品編號為B86917，C26284和C26414)分別在腎包膜移植后6周，檢測到明顯的近紅外熒光信號，見圖1，直至60 d，腎臟部位有明顯的組織隆起。70 d后手術(shù)切除腎包膜中生長的腫瘤組織進(jìn)行裸鼠皮下移植，大約在20 d皮下形成明顯的隆起，移植30 d后取皮下瘤組織進(jìn)行傳代直至F3代。

圖1 人胃癌組織裸鼠腎包膜移植近紅外熒光成像Fig.1 Near infrared fluorescence imaging of human gastric cancer tissue xenografted under the renal capsule of nudemice

2.2 PDX模型腫瘤生長曲線

F3代腫瘤組織移植于裸鼠皮下后，在不同時(shí)間點(diǎn)測定腫瘤體積，結(jié)果見圖2，隨著時(shí)間的延長腫瘤體積增大，其生長特性符合腫瘤增殖的生物學(xué)特性。

2.3 NIRF強(qiáng)度與PDX腫瘤體積的相關(guān)性

將3例移植成功的PDX模型腫瘤組織皮下移植裸鼠，進(jìn)行近紅外熒光活體成像并測定不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤部位近紅外熒光強(qiáng)度。結(jié)果見圖3，腫瘤的體積與熒光強(qiáng)度具有較好的相關(guān)性，擬合曲線中r值分別達(dá)到0.980、0.996、0.996。

2.4 PDX腫瘤組織與患者腫瘤組織病理形態(tài)比較

將PDX腫瘤組織與患者腫瘤組織石蠟切片進(jìn)行HE染色后，光鏡下觀察腫瘤組織的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果如圖4，PDX移植腫瘤較好的保持了原發(fā)腫瘤的結(jié)構(gòu)特征，二者具有較好的相似性。

圖2 人胃癌組織裸鼠皮下移植生長曲線Fig.2 The growth curves of human gastric cancer tissue transplanted subcutaneously into nudemice

2.5 PDX腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色

PDX腫瘤組織的免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖5。3個(gè)PDX模型腫瘤組織中HIF1α和OATP1B3表達(dá)均呈強(qiáng)陽性，HIF1α主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，而OATP1B3主要表達(dá)在胞質(zhì)中。

3 討論

PDX模型的移植效果除了受腫瘤自身特性影響外，移植部位、手術(shù)技巧、移植標(biāo)本的分選、受體鼠的免疫缺陷狀態(tài)、甚至移植小鼠的飼養(yǎng)管理等，都會影響到模型的成功率[6-7］。裸鼠皮下移植是建立PDX模型較常使用的方法，該方法簡單易于觀察，但移植成功率較低，只有約25%，特別是惡性程度較低、分期較早的腫瘤移植后不易生長。腎包膜由于血供豐富，組織相容性好等優(yōu)點(diǎn)是較理想的移植部位，成功率甚至可達(dá)到70%以上。但該方法對移植者的技術(shù)要求較高，且成瘤后不易觀察，往往失去連續(xù)傳代的機(jī)會[8-10］。

NIRF染料是一類聚甲基菁染料的雜環(huán)化合物，它是由兩端或中間的雜環(huán)、芳環(huán)與分子內(nèi)部的多次甲基鏈組成的一個(gè)大π共軛體系，吸收及發(fā)射光譜均處于近紅外區(qū)（700～1000 nm)之間；自發(fā)熒光低，但與體內(nèi)大分子結(jié)合后由于熒光團(tuán)的聚集展示出強(qiáng)的熒光；具有了良好的組織滲透性，激發(fā)的近紅外光在生物組織中的穿透深度較大，可直接特異性識別腫瘤細(xì)胞，并成功應(yīng)用于腫瘤活體成像研究[11、12］。

本研究將近紅外熒光活體成像技術(shù)成功運(yùn)用于人體腫瘤標(biāo)本裸鼠腎包膜移植模型的早期篩查，獲得了3個(gè)人體胃癌PDX移植模型。結(jié)果顯示通過腎包膜移植輔助近紅外熒光活體成像技術(shù)，在腫瘤移植6周后均能檢測到較強(qiáng)的熒光信號，而常規(guī)皮下移植，需要觀察2個(gè)月以上才能決定移植是否成功。5例標(biāo)本有3例通過腎包膜移植成功，并能夠皮下傳至3代以上且凍存復(fù)蘇后可以生長，移植成功率高于常規(guī)皮下移植。為了確保PDX移植腫瘤的異質(zhì)性，移植腫瘤傳代一般維持在5代之內(nèi)[13、14］。

圖3 腫瘤體積與近紅外熒光強(qiáng)度的相關(guān)性Fig.3 The correlation of tumor size and near infrared fluorescence intensity

圖4 PDX腫瘤組織與患者腫瘤組織HE染色Fig.4 Histology of PDX tumor tissues and human tumor tissues.HE staining.

圖5 PDX模型腫瘤組織HE染色與免疫組化結(jié)果Fig.5 Histology of the PDX tumor tissues.HE and immunohistochemical staining.

本研究使用的近紅外熒光染料IR-783具有成像和靶分子的雙重功能，不需要連接腫瘤特異性的分子即可識別腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞線粒體中聚集，這可能與腫瘤細(xì)胞中HIF1α和OATP1B3的高表達(dá)密切相關(guān)[15、16］。應(yīng)用近紅外熒光活體成像技術(shù)，可早期識別深層組織的腫瘤細(xì)胞，完成腫瘤模型的早期診斷，提高PDX模型的移植成功率。通過對腫瘤部位熒光強(qiáng)度的連續(xù)測定，證實(shí)腫瘤大小與熒光強(qiáng)度密切相關(guān)，生長曲線符合腫瘤的增殖特性。病理學(xué)分析和免疫組織化學(xué)檢測顯示移植的PDX腫瘤組織較好的保持了原發(fā)腫瘤的組織結(jié)構(gòu)特征，為胃癌的發(fā)病機(jī)制和藥物篩選提供了接近臨床特征的動(dòng)物模型。

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Application of near infrared fluorescent dje in the studj of patient-derived gastric cancer xenograft nudemousemodels

ZHAO Ning-ning1，2，ZHANG Cai-qin2，ZHAO Yong2，YANG Li1，2，ZHANG Hai2，LIU Yi-lun1，SHIChang-hong1，2
（1.Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.Laboratory Animal Center of the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032)

ObjectiveTo establish a patient-derived gastric cancer xenograft（PDX)model in nudemice and to investigate the application of near infrared fluorescent（NIRF)dye IR-783 in in vivo imaging of gastric cancer xenograftmodels.M ethodsFresh human gastric cancer tissuewas taken and transplanted into the subrenal capsule of nudemice to establish the xenograftmodel.When the transplanted tumors grew，took part of the tumor tissue to do HE staining and compare the structural characteristicswith the primary tumor.Another portion of the tumorwas xenografted into nudemice subcutaneously.Twenty days later，the tumor-bearingmice were injected intraperitoneally with IR-783 dye（10μM)in a dose of 100 mg/20 g.The intensity of the tumor image wasmonitored by optical NIRF imaging.The correction between tumor volume and fluorescence intensitywas analyzed.Finally，the expression of OATP1B3 and HIF1αin the xenografted tumor tissuewas detected by immunohistochemistry.ResultsWe successfully established three patient-derived xenograft（PDH)models of human gastric cancer.The transplanted tumor tissues maintained the histological characteristics of the primary tumor well.NIRF signal can be detec ted in subrenal capsule of the xenografted nudemice.The correlation between tumor size and fluorescence intensity in the PDX models reached higher than 98%.Strong positive expressions of HIF1αandOATP1B3 in the tumor tissues were detected.ConclusionsNIRF dye IR-783 can be specifically accumulated at the tumor site，therefore，can be used to detect PDX in vivo early.The tumor targeting propertymay be related to the expression of OATP1B3 and HIF1α.

Patient-derived tumor xenograft（PDX)model；IR-783；HIF1α；OATP1B3；Nudemice

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0643-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.019

2015-07-16

軍隊(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專項(xiàng)課題資助（SYDW2014-002)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31572340)。

趙寧寧（1985-)，女，碩士生，主管護(hù)師，主要研究方向:人體腫瘤模型的分子影像。E-mail:289147229@qq.com。

師長宏（1973-)，男，博士生導(dǎo)師，教授，主要研究方向:人類疾病動(dòng)物模型。E-mail:changhong@fmmu.edu.cn。