早期瘤胃微生物區(qū)系發(fā)育及其調(diào)控

田 可 柳君輝 董國(guó)忠

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400716)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃的研究不再局限于生理生化指標(biāo)與發(fā)酵參數(shù)，而是拓展到了更深層次的瘤胃微生物對(duì)動(dòng)物整體的作用層面。瘤胃微生物主要由細(xì)菌、古生菌和真核生物(真菌和原蟲)構(gòu)成[1]，而單是其中的細(xì)菌數(shù)量都遠(yuǎn)多于宿主動(dòng)物細(xì)胞數(shù)量[2]。反芻動(dòng)物瘤胃微生物能夠?qū)暭Z中養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為可供反芻動(dòng)物(宿主)吸收利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以瘤胃微生物充當(dāng)了主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換者[3]。同時(shí)，瘤胃微生物對(duì)動(dòng)物代謝和健康也發(fā)揮著重要作用。

早期瘤胃微生物區(qū)系是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。隨著對(duì)反芻動(dòng)物早期瘤胃微生物區(qū)系的研究逐漸增多，研究者們發(fā)現(xiàn)腹瀉和斷奶應(yīng)激等一系列多發(fā)于幼齡動(dòng)物的問(wèn)題都與早期瘤胃微生物區(qū)系的變化以及紊亂有關(guān)，而針對(duì)于這些問(wèn)題的解決方法也有了許多研究進(jìn)展。本文主要就牛、羊的早期瘤胃微生物區(qū)系發(fā)育及其影響因素和調(diào)控效果進(jìn)行綜述，為在實(shí)際生產(chǎn)中更好地改進(jìn)幼畜健康狀況和生長(zhǎng)性能提供參考。

1 早期瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)

1.1 早期瘤胃微生物區(qū)系

早期瘤胃指的是沒(méi)有發(fā)育完全的反芻動(dòng)物瘤胃，相比于成熟瘤胃較為齊全的功能，早期瘤胃在微生物種類和數(shù)量的發(fā)育程度都不如成熟瘤胃。部分研究將3～4周齡以后的瘤胃微生物區(qū)系定義為成熟瘤胃[4-6]，在這段時(shí)間過(guò)后，瘤胃微生物區(qū)系基本定型而且很難再改變(除非飼糧或者動(dòng)物健康狀況發(fā)生巨大變化)；但也有研究表明，從出生到2歲的時(shí)間段內(nèi)瘤胃微生物區(qū)系都可能有較大變化[7-8]。雖然在瘤胃最終發(fā)育完全的時(shí)間上存在爭(zhēng)議，但瘤胃微生物區(qū)系最終都會(huì)根據(jù)飼糧以及環(huán)境等各種影響因素穩(wěn)定后而呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，所以早期瘤胃應(yīng)該是瘤胃微生物區(qū)系還未完全穩(wěn)定的時(shí)間段[9]。

初生反芻動(dòng)物瘤胃一直被認(rèn)為是無(wú)菌的[10-11]，是隨著初生反芻動(dòng)物對(duì)母乳的攝入和環(huán)境的接觸，微生物才開始在瘤胃中出現(xiàn)然后繁殖擴(kuò)增。大量試驗(yàn)表明，反芻動(dòng)物瘤胃為厭氧環(huán)境，其中的細(xì)菌也全部都是厭氧菌。但是早期的瘤胃微生物不完全都厭氧。以前通過(guò)傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)早期的瘤胃微生物區(qū)系含有需氧菌和兼性厭氧菌，但是隨著幼齡反芻動(dòng)物的成長(zhǎng)，這一類菌群被厭氧菌完全取代[12]。最近，通過(guò)焦磷酸測(cè)序?qū)?～3日齡犢牛的研究獲得了相同的結(jié)論[8]。雖然需氧菌和兼性厭氧菌被證明存在過(guò)，但是存在時(shí)間較短，加上現(xiàn)在常用的新一代基因測(cè)序也有一定局限(如在測(cè)序時(shí)無(wú)法復(fù)原之前打斷的密碼子片段等)[13-14]，所以還沒(méi)有研究報(bào)道過(guò)這類細(xì)菌在反芻動(dòng)物早期瘤胃中的作用以及是否對(duì)幼齡動(dòng)物的生長(zhǎng)以及其他性能具有影響。

成熟反芻動(dòng)物瘤胃中主要細(xì)菌及相對(duì)豐富度為：厚壁菌門56%、擬桿菌門31%、變形菌門4%[15-16]。在幼齡反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)也可以檢測(cè)到這3類細(xì)菌，不過(guò)占比并不遵循成熟反芻動(dòng)物瘤胃的規(guī)律。較之于成熟反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系的較穩(wěn)定狀態(tài)，早期瘤胃微生物區(qū)系隨著出生后時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)有數(shù)量和種類上的明顯變化。研究發(fā)現(xiàn)，8～10月齡犢牛瘤胃微生物區(qū)系中細(xì)菌的操作分類單元(OTU)有2 095個(gè)，其中有24個(gè)細(xì)菌門類能被檢測(cè)到[17]；但7～63日齡的犢牛瘤胃微生物區(qū)系中細(xì)菌的OTU只有1 588個(gè)，能檢測(cè)到的只有23個(gè)細(xì)菌門類[18]。具體到細(xì)菌種類上，Jami等[8]使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)初生犢牛的瘤胃微生物區(qū)系的研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門在出生后第1～3天時(shí)占比極高，甚至超過(guò)厚壁菌門和擬桿菌門，但是隨著時(shí)間的推移，變形菌門的占比逐漸減少；Rey等[5]研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門在第3天成為占比最高的菌門，在83日齡前最高時(shí)甚至可以占到62.1%。雖然上述2個(gè)研究都表明瘤胃微生物區(qū)系最終發(fā)展方向符合成熟后三大菌群的大致占比，但是可以看出早期瘤胃微生物區(qū)系受年齡的影響非常大。

在比較同種動(dòng)物不同年齡的早期瘤胃微生物區(qū)系變化時(shí)，飼糧是一個(gè)重要的干擾因素[19]。所以筆者認(rèn)為必須要在飼喂相同飼糧的情況下才能比較出年齡對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響，如果要將飼糧誤差控制到最小，只能比較僅在母乳飼喂條件下的早期瘤胃微生物區(qū)系。為了得出比較有依據(jù)的早期瘤胃微生物區(qū)系隨年齡變化而發(fā)生的改變，我們根據(jù)一些試驗(yàn)結(jié)果[5,8,20]總結(jié)出了僅飼喂母乳條件下年齡為單一變量的早期瘤胃細(xì)菌種類的變化(表1)。

表1 僅飼喂母乳的犢牛瘤胃細(xì)菌種類的變化

“√”表示能檢測(cè)到；“○”表示不能被大量檢測(cè)到(相關(guān)豐富度<1.0%)或者不清楚；“—”表示沒(méi)有試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

“√” represents being detected; “○” represents not being largely detected (relative abundance<1.0%) or being unclear; “—” represents a lack of experimental data.

值得一提的是，最近有研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)山羊在出生后80～100 d內(nèi)，除了變形菌門和厚壁菌門，互養(yǎng)菌門成為了瘤胃內(nèi)三大細(xì)菌門類之一(占比超過(guò)了30%)，第110天后才被擬桿菌門取代[21]。這是以前的研究所沒(méi)有觀察到的，說(shuō)明了早期瘤胃微生物區(qū)系在特定時(shí)間段內(nèi)可能會(huì)有不同規(guī)律的變化，所以今后對(duì)早期瘤胃微生物種類的測(cè)定可能需要更加精確的時(shí)間段。

1.2 瘤胃上皮與瘤胃微生物區(qū)系

瘤胃上皮主要指瘤胃乳頭和瘤胃黏膜。瘤胃微生物區(qū)系發(fā)酵產(chǎn)物直接作用于瘤胃上皮后再作用于動(dòng)物機(jī)體，而且瘤胃微生物的種類以及數(shù)量與瘤胃上皮的發(fā)育存在相互作用關(guān)系[19,22]。因此，涉及到瘤胃微生物區(qū)系發(fā)育時(shí)，有必要同時(shí)考慮到瘤胃上皮。但是，在研究早期瘤胃微生物區(qū)系時(shí)應(yīng)該有明確的瘤胃上皮發(fā)育時(shí)期，因?yàn)榱鑫冈谠缙谑菦](méi)有消化能力的，此時(shí)的反芻動(dòng)物如同單胃動(dòng)物，處在皺胃單獨(dú)發(fā)揮消化吸收作用的單胃時(shí)期。單胃時(shí)期之后的瘤胃乳頭以及黏膜組織的發(fā)育是由瘤胃微生物在消化飼糧后的產(chǎn)物誘導(dǎo)下發(fā)育的，而且飼糧成分的不同會(huì)導(dǎo)致各種微生物的比例不同[23-24]。需要注意的是，瘤胃黏膜上與瘤胃食糜中的微生物區(qū)系也有差別。Mao等[25]對(duì)成年牛整個(gè)胃腸道(GIT)的黏膜上和食糜中的微生物測(cè)序發(fā)現(xiàn)，黏膜上OTU為6 327個(gè)，而食糜中OTU為5 573個(gè)；瘤胃中，厚壁菌門和擬桿菌門在食糜中的豐富度顯著大于黏膜上；相反，變形菌門在黏膜上豐富度顯著高于厚壁菌門和擬桿菌門。而Malmuthuge等[26]對(duì)斷奶前犢牛(7日齡)的GIT測(cè)序發(fā)現(xiàn)，黏膜上OTU為6 051個(gè)，食糜中OTU為7 374個(gè)；同樣是瘤胃中，擬桿菌門在黏膜上和食糜中的豐富度都是最高的。

2 影響早期瘤胃微生物區(qū)系的因素

瘤胃微生物區(qū)系發(fā)育被認(rèn)為是由無(wú)菌到被各種微生物占領(lǐng)的過(guò)程，而瘤胃微生物區(qū)系通過(guò)改變自身成分與數(shù)量使反芻動(dòng)物宿主獲得對(duì)飼糧或環(huán)境變化的適應(yīng)能力。早期瘤胃微生物是在各方面的影響下發(fā)育的，也正是這些影響，才使早期瘤胃微生物區(qū)系最終發(fā)育成對(duì)飼糧及環(huán)境適應(yīng)、對(duì)宿主有利而且較為穩(wěn)定的狀態(tài)。

2.1 母體

反芻動(dòng)物出生時(shí)從母體處獲得的微生物可以認(rèn)為是最早出現(xiàn)在瘤胃中的微生物，母體對(duì)早期瘤胃微生物區(qū)系的影響主要可以分為2種：出生時(shí)動(dòng)物與母體的接觸、動(dòng)物出生后對(duì)初乳的攝取。從出生到出生后第20天時(shí)，在犢牛的瘤胃內(nèi)能檢測(cè)到與母體陰道內(nèi)和初乳中相同的微生物[27]。據(jù)報(bào)道[9]，從出生到出生后第2周的幼齡反芻動(dòng)物體內(nèi)的原蟲來(lái)源于動(dòng)物之間的相互舔舐，因?yàn)樵x存在于動(dòng)物唾液中，如果剛出生時(shí)就立即與其他反芻動(dòng)物隔離，則不能在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)檢測(cè)到原蟲。Abecia等[6]將出生后的羊分為跟隨母羊和離開母羊2種培育方式，前者使羔羊瘤胃細(xì)菌豐富度在出生后第3、5、7、14天時(shí)顯著增加，而且最明顯的是原蟲快速增多；而后他們以同樣的試驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)螺旋菌門在跟隨母羊的羔羊瘤胃內(nèi)顯著增多，擬桿菌屬則始終比與離開母羊的羔羊多[28]。

有研究發(fā)現(xiàn)，即使在母牛分娩前用無(wú)菌水清洗了母牛的陰道、肛門、尾巴和腿(分娩時(shí)胎兒直接或間接接觸到母牛的部位)，且分娩時(shí)用無(wú)菌布接生犢牛，還是能在出生后20 min的犢牛瘤胃內(nèi)檢測(cè)到產(chǎn)甲烷菌(Methanobrevibactermobile、Methanobrevibactervotae和Methanobrevibacterspp)、纖維降解細(xì)菌(Fibrobactersuccinogenes、Ruminococcusflavefaciens和Prevotellaruminicola)和地桿菌(Geobacterspp.)[4]。同時(shí)，最近有研究通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)同父異母的犢牛瘤胃微生物測(cè)序得出，瘤胃微生物在親子代之間可能具有傳遞性[29]。顯然，這一系列的結(jié)果證明早期瘤胃微生物除了與母體接觸及初乳攝取獲得外，早期瘤胃微生物還有可能在胎兒時(shí)期就直接從母體內(nèi)獲得。

2.2 開食料

開食料是反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中比較常用的早期飼糧，通常是配合母乳或者代乳品一起使用，也是決定斷奶成敗的關(guān)鍵。在羔羊上，普雷沃氏菌科的豐富度在開食料飼喂后能從31%變?yōu)?8%而成為瘤胃內(nèi)豐富度最大的細(xì)菌[5]；如果給10日齡羔羊飼喂開食料，瘤胃上皮上的互養(yǎng)菌門豐富度在第56天屠宰時(shí)比沒(méi)有飼喂開食料的羔羊顯著增加，變形菌門、無(wú)壁菌門和候選菌門的豐富度則減少，而且從細(xì)菌屬類上改變了一些沒(méi)有歸類細(xì)菌的豐富度[30]。對(duì)于飼喂牛奶或飼喂牛奶+精料的犢牛，可以從第28天開始觀察到飼喂牛奶的犢牛瘤胃內(nèi)放線菌門的占比開始降低[20]。在另外的研究中，只飼喂精料的犢牛瘤胃中有47種細(xì)菌屬，而飼喂精料+牧草的犢牛瘤胃中細(xì)菌屬類變?yōu)?2種，而且普氏菌屬顯著增多[31]。

2.3 斷奶

斷奶期能比較明顯地觀察到瘤胃微生物區(qū)系的變化[16,22]。Meale等[32]用16S rRNA基因測(cè)序法對(duì)斷奶期犢牛瘤胃微生物區(qū)系測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)OTU和多樣性(Chao1和Shannon指數(shù))減少，同時(shí)擬桿菌門在瘤胃中的豐富度從斷奶前的66.1%顯著降至斷奶后的42.2%，放線菌門和疣微菌門的豐富度也顯著降低；相反，變形菌門和厚壁菌門的豐富度在斷奶后顯著增加。之后他們?cè)诹硪粋€(gè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，瘤胃中擬桿菌門的豐富度原本大于厚壁菌門，斷奶造成了擬桿菌門的豐富度降低，使厚壁菌門成為瘤胃中豐富度最高的細(xì)菌[33]。而且斷奶方式(早期或推遲)并不影響最終三大菌門在瘤胃微生物區(qū)系內(nèi)的占比[32-33]。雖然大部分研究都表明斷奶的確會(huì)引起幼齡反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系的巨大改變，但是還沒(méi)有任何研究表明能通過(guò)斷奶或斷奶方式改變瘤胃中占主導(dǎo)地位的幾種菌群。不過(guò)，推遲斷奶能讓試驗(yàn)動(dòng)物的微生物區(qū)系變化減緩，可避免因早期斷奶時(shí)微生物區(qū)系的劇烈變化而造成的應(yīng)激[34]。

2.4 動(dòng)物種類和品種

包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物胃腸道微生物區(qū)系會(huì)因?yàn)閯?dòng)物種類的不同而有差別[2]。例如，同為反芻動(dòng)物的牛和羊的胃腸道微生物區(qū)系就有差別。其中，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)和丙酸菌屬(Propionibacterium)在羔羊(6～9月齡)瘤胃上皮上的豐富度是最高的；而在犢牛(9～11月齡)瘤胃中，梭菌屬(Clostridium)代替了雙歧桿菌屬并與其他3種菌屬類成為了豐富度較高的細(xì)菌；而且，羔羊瘤胃黏膜上的細(xì)菌總量多于犢牛[35]。同一動(dòng)物種類不同品種之間胃腸道微生物區(qū)系也會(huì)存在差別，如不同奶牛品種(荷斯坦和娟姍牛)的瘤胃微生物種類也不同，荷斯坦牛的細(xì)菌豐富度在OTU和Chao1指數(shù)上都要顯著高于娟姍牛[36]。對(duì)比不同地區(qū)3日齡的荷斯坦?fàn)倥?，在法?guó)[5]的研究表明擬桿菌門為豐富度最高的菌門，而在以色列[8]和美國(guó)[27]的研究則表明變形菌門為豐富度最高的菌門。如果以同一地區(qū)同一品種為研究對(duì)象，犢牛瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的種類會(huì)因?yàn)閯?dòng)物個(gè)體的不同而具有較大的差異[37]。

3 對(duì)早期微瘤胃微生物區(qū)系的調(diào)控

對(duì)早期瘤胃微生物的調(diào)控可在一定程度上減少幼齡反芻動(dòng)物多發(fā)的腹瀉甚至死亡等問(wèn)題[38]，也能在減少疾病給反芻動(dòng)物養(yǎng)殖帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)提高幼齡反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。

使用益生菌(以乳酸菌和雙歧桿菌為主)不僅能直接調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵參數(shù)，而且有助于其他有益菌的生長(zhǎng)[39]。Qadis等[40]在晨飼前給荷斯坦?fàn)倥(12±3)周齡)]飼喂乳酸菌，與對(duì)照組(不飼喂乳酸菌)相比，飼喂乳酸菌后第7天和第14天觀察到了擬桿菌數(shù)量增多，并伴隨著瘤胃pH的升高和瘤胃氨態(tài)氮含量的增多。Foditsch等[38]在用牛奶飼喂?fàn)倥?2日齡)1 h后再飼喂普氏棲糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii)，發(fā)現(xiàn)犢牛糞便中Faecalibacteriumprausnitzii的數(shù)量增多，同時(shí)顯著降低了犢牛的腹瀉率和死亡率，而且犢牛日增重在斷奶期間顯著提高。

益生元主要以糖類和酵母培養(yǎng)物為主，而甘露聚糖、纖維低聚糖與酵母培養(yǎng)物則是其中比較常用的類型。據(jù)報(bào)道，在斷奶前后的犢牛飼糧中添加益生元雖然可以一定程度上改善犢牛的生長(zhǎng)性能，但是并不能顯著改變瘤胃微生物區(qū)系，而且益生元的添加對(duì)健康犢牛的作用很小[39,41]。

離子載體中莫能菌素等則是比較常用的種類，在犢牛飼糧中添加莫能菌素可以顯著降低瘤胃中厚壁菌門和螺旋菌門的豐富度，同時(shí)顯著提高瘤胃pH并降低甲烷產(chǎn)量[42]。

瘤胃液接種也是調(diào)控幼齡動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系的方法。有研究表明，接種母羊瘤胃液可以顯著增加羔羊瘤胃微生物的數(shù)量以及豐富度，提高羔羊的日增重以及飼糧干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的消化率，并且不會(huì)影響羔羊的健康狀況和采食量。但是，接種后的效果會(huì)隨時(shí)間推移逐漸消失[43-44]。

在出生到3月齡羔羊飼糧中添加溴甲烷(BCM)，到6月齡時(shí)，顯著減少了產(chǎn)甲烷菌數(shù)量與甲烷產(chǎn)量；如果同時(shí)在產(chǎn)羔到第2個(gè)月羔羊斷奶期間的母羊飼糧中添加BCM，能使羔羊的日增重顯著提高[45]。如果在2～6周齡羔羊飼糧中添加亞麻籽油，到羔羊16周齡時(shí)，羔羊瘤胃內(nèi)甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)和甲烷球形菌屬(Methanosphaera)的豐富度顯著降低，而且添加亞麻籽油對(duì)羔羊的日增重和采食量以及健康狀況沒(méi)有顯著影響[46]。

4 小 結(jié)

早期瘤胃微生物區(qū)系相對(duì)于成年動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系簡(jiǎn)單但是比較特殊，因?yàn)榇嬖谝恍┍容^明顯的變化過(guò)程：有類似單胃動(dòng)物的皺胃單獨(dú)發(fā)揮作用的時(shí)期，也有需氧菌與厭氧菌互換的時(shí)期，同時(shí)也存在有斷奶前與斷奶后的時(shí)期。同時(shí)，早期瘤胃微生物區(qū)系發(fā)育受到許多因素影響。對(duì)早期瘤胃微生物的調(diào)控可在一定程度上減少幼齡反芻動(dòng)物多發(fā)的腹瀉甚至死亡等問(wèn)題，并在減少疾病給反芻動(dòng)物養(yǎng)殖帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)提高生長(zhǎng)性能。由于瘤胃微生物的種類繁多且功能各異，加上研究手段不足，目前對(duì)早期瘤胃微生物區(qū)系的認(rèn)識(shí)只是管中窺豹，但是隨著今后研究工作的積累，我們對(duì)早期瘤胃微生物區(qū)系的認(rèn)識(shí)及其調(diào)控會(huì)上升到一個(gè)新臺(tái)階。