28種AM真菌對(duì)滇重樓中薯蕷皂苷元含量的影響

王 騫，張輝菊，楊 敏，張 華 ，周 濃，李 楊

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404120；3.三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 404120；4.大理大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，云南大理 671003）

滇重樓（Parispolyphyllavar.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.）為百合科重樓屬植物云南重樓的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛等功效，在西南地區(qū)是著名的具有產(chǎn)業(yè)化利用主導(dǎo)地位的中藥材，已被列為國家重點(diǎn)保護(hù)二級(jí)瀕危藥用植物〔1-3〕。隨著市場需求量不斷增加，供需矛盾日益突出，人工栽培技術(shù)雖不斷提高，可在一定程度上緩解該矛盾，但仍存在入藥質(zhì)量不穩(wěn)定等問題〔4-8〕?，F(xiàn)有研究表明叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌可以提高多數(shù)藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)〔9-10〕，為解決入藥質(zhì)量不穩(wěn)定這一問題，本研究通過對(duì)滇重樓根莖部位接種28種不同的AM真菌，探討AM真菌對(duì)其侵染率和品質(zhì)的影響，并篩選出可以提高其主要藥用品質(zhì)指標(biāo)成分含量的AM真菌菌種，從而為人工栽培滇重樓施用生物肥料，提高入藥品質(zhì)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100 LC高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RV 10 basic V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA集團(tuán)）；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；CP225D型分析天平（德國Sartorius公司）；FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 試藥 薯蕷皂苷元對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：A0124，含量≥98%）；乙腈（色譜純，美國Tedia試劑公司）；水為娃哈哈純凈水；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 供試材料與培養(yǎng) AM真菌均為AM真菌純凈菌劑（購于美國國際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心），接種菌劑為帶有菌絲、孢子及侵染后根段的栽培基質(zhì)的混合物〔11-12〕。不同處理組接種AM 真菌種類為：Ga處理組（Gigaspora albida）、Gd處理組（G.decipiens）、Gg處理組（G.gigantea）、Gm處理組（G.margarita）、Gr處理組（G.rosea）、Sca處理組（Scutellospora calospora）、Sdi處理組（S.dipurpura-scens）、Spe處理組（S.pellucida）、Dh處理組（Dentiscutata heterogama）、Rco處理組（Racocetra coralloidea）、Rfu處理組（R.fulgida）、Sde處理組（Septoglomus deserticola）、Svi處理組（S.viscosum）、Cc處理組（Claroideoglomus claroideum）、Fm處理組（Funneliformis mosseae）、Rcl處理組（Rhizophagus clarus）、Rin處理組（R.intraradices）、Afo處理組（Acaulospora foreata）、Ako處理組（A.koskei）、Asc處理組（A.scrobiculata）、Asp處理組（A.spinosa）、De處理組（Diversispora eburnea）、Ds處理組（D.spurca）、Ec處理組（Entrophospora colombiana）、Pb處理組（Paraglomus brasilianum）、Po處理組（P.occultum）、Ale處理組（Ambispora leptoticha）、Atr處理組（Archaeospora trappei）〔13-14〕。

實(shí)驗(yàn)樣品選自大理州農(nóng)科院種植基地大小基本一致的滇重樓新鮮根莖，經(jīng)重慶三峽學(xué)院周濃教授鑒定為百合科重樓屬植物滇重樓P.polyphyllavar.yunnanensis。栽培袋用10%次氯酸鈉溶液浸泡15 min后，用自來水沖洗干凈。栽培基質(zhì)為重慶三峽學(xué)院百安校區(qū)的菜園土與河沙的混合物（體積比為3：1，過2 mm篩后，在121℃的高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌2 h）。采用室溫盆栽栽培的方法，設(shè)為AM組（接種28種AM真菌）和CK組（對(duì)照組），共29個(gè)處理組。每個(gè)處理組分別有6個(gè)平行，每盆栽種15株滇重樓。選擇大小一致的滇重樓根莖，將菌土均勻施于滇重樓根莖部，接種劑量為每盆15 mL（每1 mL大約含有60個(gè)孢子）。接種后在室溫（自然光照）條件下培養(yǎng)。生長期間，定期澆灌Hoagland營養(yǎng)液。

2 方法與結(jié)果

2.1 叢枝菌根對(duì)滇重樓根系菌根侵染率的影響隨機(jī)選取滇重樓根系30條，剪成長約1.0 cm的根段，采用曲利本藍(lán)染色法進(jìn)行AM真菌的侵染率測定〔15〕。由圖1可以看出，各處理組的滇重樓根系均被AM真菌侵染，并形成了叢枝菌根結(jié)構(gòu)，但侵染強(qiáng)度卻有所不同。同時(shí)，CK組滇重樓根系侵染率不為0.00%，可能是前期栽培土壤中含有一定量的真菌類群，致使滇重樓成年植株根系具有一定的菌根侵染，與周濃等〔8〕的研究結(jié)果一致。見圖1。與CK 組相比，Gg、Gm、Sca、Spe、Dh、Rco、Rfu、Sde、Cc、Rin和Ds共11種AM真菌對(duì)滇重樓根系侵染率最高，在59.00%～75.40%，且這11種AM真菌侵染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與CK 組相比，Ga、Gd、Svi、Afo、Ako、Asc、Asp、De、Ec、Pb、Po、Ale和Atr共13種AM真菌對(duì)滇重樓根系侵染率居中，在40.00%～50.00%，且這13種AM真菌侵染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Gr、Sdi、Fm和Rcl共4種AM真菌對(duì)滇重樓根系侵染率最低，在25.40%～32.60%，且這4種AM真菌侵染率與CK組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，28組AM真菌都對(duì)滇重樓有一定的侵染。由此可見，接種外源AM真菌對(duì)滇重樓根內(nèi)AM真菌的侵染率、侵染強(qiáng)度具有調(diào)控作用。

圖1 接種不同AM真菌對(duì)滇重樓根系菌根侵染率的影響

2.2 叢枝菌根對(duì)滇重樓薯蕷皂苷元的含量測定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷元適量用甲醇溶解，配成0.539 mg∕mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.250 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇，超聲提取40 min，靜置放冷，過濾，再加入20 mL甲醇，超聲提取40 min，放冷，過濾，合并2次提取液，回收甲醇，殘?jiān)尤? mol∕L鹽酸7.5 mL，置于100℃水浴鍋中水解2 h，冷卻后萃取3次，每次用30 mL石油醚（60～90℃），萃取時(shí)間分別為45、40、30 min。合并3次萃取液，并回收石油醚至干，殘?jiān)眉状既芙庵?0 mL量瓶中，定容，搖勻，即得〔16〕。

2.2.3 色譜條件 采用高效液相色譜法〔16〕測定不同處理組滇重樓薯蕷皂苷元的含量，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（90：10），流速為 1.0 mL∕min，檢測波長203 nm，柱溫35℃。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取1、2、5、10、15、20、25 μL對(duì)照品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，得出以峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量濃度C為橫坐標(biāo)的線性回歸方程，A=649 532C+160 81（r=0.999 1）。線性范圍為0.539～13.475 μg∕mL。

2.2.5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn)通過對(duì)薯蕷皂苷元含量測定進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果精密度試驗(yàn)RSD為0.21%（n=6）；重復(fù)性試驗(yàn)RSD為2.13%（n=6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為1.29%（n=6）；平均加樣回收率為96.52%（n=6），RSD為2.16%（n=6）。結(jié)果均符合含量測定的要求。

2.2.6 測定結(jié)果 大部分AM真菌處理組中薯蕷皂苷元含量與CK組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其含量波動(dòng)范圍在（0.978 2 ±0.095 1）mg∕g（Sdi）到（8.153 0±0.774 8）mg∕g（Pb）之間。但經(jīng)過Dh和Svi真菌處理后的滇重樓根莖中，薯蕷皂苷元含量均有提高。其中用Dh真菌處理過的根莖的薯蕷皂苷元含量為10.745 3 mg∕g，Svi處理組的薯蕷皂苷元含量為41.404 5 mg∕g，提高得最為明顯。這兩組與CK組的含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？梢夾M真菌處理對(duì)滇重樓根莖中薯蕷皂苷元含量有影響，尤其是Svi真菌。見表1。

表1 不同AM真菌處理組的薯蕷皂苷元含量

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同處理組的滇重樓根莖均能與28種AM真菌形成共生關(guān)系，但不同AM真菌對(duì)滇重樓中薯蕷皂苷元含量的影響不同。接種AM真菌處理組的滇重樓菌根侵染率普遍高于CK組，部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，部分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與周濃等〔16〕、楊光等〔17〕研究結(jié)果相一致。滇重樓的主要活性成分是甾體皂苷類化合物，包括薯蕷皂苷和偏諾皂苷等。薯蕷皂苷元是薯蕷皂苷水解得到的產(chǎn)物〔18-19〕，薯蕷皂苷元在制藥行業(yè)應(yīng)用十分廣泛，是合成甾體激素類藥物的重要成分，具有解毒、抗腫瘤、抗炎、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)胃黏膜等作用，為滇重樓的有效成分和質(zhì)量控制指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AM真菌的接種有助于提高滇重樓中薯蕷皂苷元的含量，效果最佳者為Svi真菌。在周濃等〔11〕的研究中顯示接種Svi真菌，有助于提高侵染率，同時(shí)可提高重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ的含量，也間接反映了Svi真菌是有助于提升滇重樓入藥品質(zhì)的AM真菌。本研究僅針對(duì)滇重樓中一種入藥品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行檢測，在今后的研究中還應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)其他入藥品質(zhì)指標(biāo)的研究，為合理施用生物肥料，提高入藥品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。