麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫機(jī)制研究

郝俊杰，李 楊

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137）

甘草麻黃湯出自張仲景《金匱要略》，由甘草和麻黃兩味藥組成，主治“里水，一身面目黃腫”。麻黃和甘草配伍具有利水消腫的功效，在麻黃湯、葛根湯、越婢湯、麻杏石甘湯等中醫(yī)名方中廣泛使用。麻黃-甘草在臨床使用過(guò)程中逐漸形成常用的相對(duì)固定的配伍形式，即“藥對(duì)”〔1-3〕。麻黃-甘草藥對(duì)對(duì)水腫的治療作用及其相關(guān)的利尿作用已有文獻(xiàn)報(bào)道，但其藥效成分和療效機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

中藥治療疾病是多成分、多途徑、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的結(jié)果，采用系統(tǒng)生物學(xué)等技術(shù)方法可以全面、準(zhǔn)確把握中藥治療疾病的整體特征。2007年Hopkins等提出了“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”的概念，通過(guò)分析藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的作用網(wǎng)絡(luò)，為藥物研發(fā)及中藥作用分析提供了新的策略〔4-5〕。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)預(yù)測(cè)中藥配伍作用機(jī)制具有天然的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)中藥及其配伍的作用機(jī)制進(jìn)行了大量的預(yù)測(cè)研究〔6-7〕。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法構(gòu)建麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的“疾病-基因-藥物”網(wǎng)絡(luò)，并預(yù)測(cè)其分子機(jī)制，揭示其治療水腫的作用靶點(diǎn)和生物學(xué)信號(hào)通路，為后續(xù)的分子生物學(xué)驗(yàn)證找到切入點(diǎn)，為藥物開(kāi)發(fā)和臨床拓展應(yīng)用提供依據(jù)。

1 方法

1.1 藥物靶蛋白和疾病基因的查找 通過(guò)中藥臺(tái)灣數(shù)據(jù)庫(kù)（TDT，http：∕∕tcm.cmu.edu.tw∕）和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP（http：∕∕lsp.nwu.edu.cn∕tcmsp.php）獲得麻黃和甘草所含的化學(xué)成分和靶點(diǎn)信息。通過(guò)人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，http：∕∕www.omim.org∕）篩選水腫相關(guān)的基因，使用Uniprot（https：∕∕www.uniprot.org∕）數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)化為蛋白格式，建立水腫靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。人類的靶點(diǎn)連接蛋白通過(guò)交互蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∕∕dip.doe-mbi.ucla.edu）獲得。為了便于統(tǒng)一分析，以上所有靶點(diǎn)均轉(zhuǎn)化成UniProt ID（蛋白編號(hào)ID）格式〔8〕。

1.2 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 先通過(guò)PPI（http：∕∕www.genome.jp∕kegg∕）分析，尋找麻黃和甘草的化學(xué)成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和水腫的疾病靶點(diǎn)的交互蛋白。然后利用Cytoscape 3.6.1軟件將麻黃和甘草的化學(xué)成分、成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)、水腫對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和交互蛋白對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)連接成“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。將以上網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，并將每個(gè)點(diǎn)的度、接近中心度等拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行評(píng)估，篩選麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的目的靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 對(duì)“1.2”項(xiàng)篩選出的靶點(diǎn)使用STRING（https：∕∕string-db.org∕）進(jìn)行蛋白互作關(guān)系分析，最后對(duì)篩選的靶點(diǎn)使用DAVID（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路分析和使用Cytoscape軟件的Blue GO插件進(jìn)行基因功能分析。

2 結(jié)果

2.1 “藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建方法，共篩選出麻黃中223個(gè)化學(xué)成分和370個(gè)靶點(diǎn)蛋白；甘草中27個(gè)化學(xué)成分和135個(gè)靶點(diǎn)蛋白。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)出麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的交互網(wǎng)絡(luò)，采用不同的形狀圖形使其可視化后，讓我們更清晰直觀地看出化合物與疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。其中方形代表藥物與疾病共同作用的靶點(diǎn)，也是麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫最重要的靶點(diǎn)蛋白；圓點(diǎn)代表藥物與疾病潛在的交互作用靶點(diǎn)；三角形代表麻黃-甘草藥對(duì)中被預(yù)測(cè)出的活性化合物。見(jiàn)圖1。

圖1 麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)

2.2 麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫作用篩選和相互作用分析 通過(guò)對(duì)Cytoscape交互網(wǎng)絡(luò)分析，得出在麻黃-甘草藥對(duì)活性成分關(guān)聯(lián)水腫的40個(gè)蛋白靶點(diǎn)。對(duì)這些蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)計(jì)算。選擇度大于中位數(shù)值2倍，介度中心度和接近中心度大于中位數(shù)值的靶點(diǎn)共同作為麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的重要靶點(diǎn)蛋白，3個(gè)拓?fù)鋮?shù)中位數(shù)分別為：4.000 00、0.002 87和0.268 03。通過(guò)篩選得到10個(gè)麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的靶點(diǎn)。見(jiàn)表1。篩選出的靶點(diǎn)的蛋白互作關(guān)系見(jiàn)圖2，蛋白相互作用關(guān)系表明篩選出麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的作用蛋白是相互關(guān)聯(lián)和彼此調(diào)節(jié)的。把麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的靶點(diǎn)相關(guān)的化學(xué)成分進(jìn)行提取。見(jiàn)圖3和表2～3。

圖2 麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的蛋白靶點(diǎn)互作關(guān)系圖

圖3 麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的靶點(diǎn)和相關(guān)的化學(xué)成分

表1 麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫篩選的靶點(diǎn)蛋白信息

表2 甘草治療水腫的靶點(diǎn)的相關(guān)化學(xué)成分信息

2.3 麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的GO功能（基因功能）分析 通過(guò)基因分析發(fā)現(xiàn)麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫主要通過(guò)以下的生物學(xué)功能：血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的調(diào)控（regulation of blood vessel endothelial cell migration）和單核細(xì)胞分化（monocyte differentiation）。見(jiàn)圖4。

2.4 麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的KEGG通路分析對(duì)“2.2”項(xiàng)中篩選出的靶點(diǎn)在KEGG通路富集分析中，篩選出15條麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的通路。主要包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路（VEGF signaling pathway）、B細(xì)胞受體信號(hào)通路（B cell receptor signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號(hào)通路（B cell receptor signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路（Neurotrophin signaling pathway）、Ras信號(hào)通路（Ras signaling pathway）等。見(jiàn)表4。

表3 麻黃治療水腫的靶點(diǎn)的相關(guān)化學(xué)成分信息

表4 麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫KEGG通路信息

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析構(gòu)建了麻黃-甘草藥對(duì)的“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的靶點(diǎn)蛋白并進(jìn)一步分析其機(jī)制。在篩選出的蛋白中，核轉(zhuǎn)錄因子（Inhibitor of nuclear factor）〔9〕、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascularendothelial growth）〔10〕、血清白蛋白（Serum albumin）〔11〕、過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ（proliferator-activated receptor gamma）〔12〕和前列腺素（Prostaglandin G∕H synthase 2）〔13〕都與水腫密切相關(guān)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路和基因功能分析得到的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的調(diào)控在麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫中發(fā)揮著極其重要的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞遷移行為〔14〕，據(jù)報(bào)道血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可通過(guò)影響內(nèi)皮緊密結(jié)合蛋白的功能增加血管通透性，造成毛細(xì)血管滲漏，抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物可以治療水腫〔15〕，因此麻黃-甘草藥對(duì)可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路來(lái)治療水腫。其他信號(hào)通路如PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、Ras信號(hào)通路（Ras signaling pathway）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）等均有報(bào)道在水腫中發(fā)揮了重要作用〔16-19〕。綜上所述，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的作用機(jī)制，能夠找到與療效相關(guān)的生物信號(hào)通路。為下一步麻黃-甘草藥對(duì)治療水腫的分子生物學(xué)驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)，本研究揭示了麻黃-甘草藥對(duì)在治療水腫方面的多維調(diào)控作用，為藥物開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。