泡菜中兼具耐酸性和亞硝酸鹽分解活性的乳酸菌株的篩選和鑒定

金成武，杜林曉，陳鑫，張悅，張斯程，劉文麗，孫舒揚

(魯東大學 食品工程學院，山東 煙臺 264025)

泡菜是我國傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的代表，它是以白菜、蘿卜等蔬菜為主要原料，經(jīng)過乳酸菌群協(xié)同發(fā)酵制成的一種發(fā)酵類食品[1,2]。泡菜口感清爽、味道鮮美，含有多種維生素及礦物質，可促進人體內腸胃蠕動、助消化，還具有降低人體內膽固醇含量的作用。乳酸菌是泡菜生產過程中的優(yōu)勢菌，在泡菜的整個發(fā)酵過程中非常重要，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmensenteroides)和短乳桿菌(L.brevis)是其中最主要的乳酸菌種[3,4]。

傳統(tǒng)的泡菜制作方式都是采用自然發(fā)酵法，發(fā)酵周期較長，產品質量不穩(wěn)定，亞硝酸鹽含量也較高[5]。亞硝酸鹽的生成和積累極大地影響了泡菜的食用安全性，因為亞硝酸鹽在酸性條件下能與胺類及氨基酸等含氮化合物反應，生成具有致癌作用的亞硝胺和亞硝酰胺[6，7]。亞硝酸鹽的生成主要在泡菜發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時間的延長，亞硝酸鹽的含量也會逐漸降低。但是工業(yè)化生產為了提高生產效率，往往縮短發(fā)酵周期，亞硝酸鹽可能仍維持在較高的濃度。因此，篩選降解亞硝酸鹽能力強且生長速率快的乳酸菌菌株對泡菜的生產和推廣應用十分重要。

本研究以市售泡菜為研究對象，從中篩選出乳酸菌，研究其基本生理生化特性、產酸性能、降解亞硝酸鹽的能力以及耐酸性，進而篩選出各方面性能都比較優(yōu)異的乳酸菌株，并對其采用API 50 CHL碳水化合物的發(fā)酵產酸試驗及分子生物學技術進行鑒定。本研究可以豐富乳酸菌菌種資源，并為其在食品工業(yè)中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

購買市售泡菜11種，產地包括煙臺、青島、廣州、北京和成都。

1.2 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖20 g，酵母粉5 g，牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，蛋白胨5 g，吐溫80 1 g，檸檬酸三銨 2 g，磷酸二氫鉀2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.05 g；pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 試劑

胰蛋白胨、乙酸鈉、牛肉浸膏：國藥集團化學試劑有限公司；引物、PCR Master Mix、細菌基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；革蘭氏染色液：南京建成科技有限公司；其他試劑：均為分析純。

1.4 儀器

生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；XSP-BM-2CA生物顯微鏡 上海彼愛姆光學儀器制造有限公司；離心機 上海安亭科學儀器廠；PCR擴增儀 杭州博日科技有限公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；FE20K pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；Cary60紫外可見分光光度計 美國Agilent公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 泡菜樣品中乳酸菌的分離純化

向10 g泡菜中加入90 mL無菌水，充分振蕩，采用梯度稀釋進行稀釋，稀釋度為101～108。吸取0.2 mL稀釋液涂于含有0.5% CaCO3的改良MRS固體培養(yǎng)基上，30 ℃厭氧箱中培養(yǎng)2～5天，觀測菌落形成情況。選取有鈣圈生成的菌落，挑取單菌落，反復進行劃線分離直至獲得純菌落。

1.5.2 乳酸菌的初步確定及形態(tài)學觀察

挑取純化后的菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶接觸試驗。革蘭氏染色呈現(xiàn)陽性且過氧化氫酶呈現(xiàn)陰性初步判斷為乳酸菌，通過革蘭氏染色鏡檢圖片記錄乳酸菌形態(tài)特征。

1.5.3 菌液pH 測定

乳酸菌菌株在改良MRS液體培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)24 h，用pH計測定菌液pH值并記錄。

1.5.4 降解亞硝酸鹽能力測定

亞硝酸鹽含量采用國標法(GB 5009.33-2010)測定。用改良的MRS液體活化保存的乳酸菌菌株，按0.2%接種量接入含亞硝酸鈉100 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于35 ℃培養(yǎng)60 h，每間隔12 h取樣，測定發(fā)酵液中的亞硝酸鹽含量。

1.5.5 耐酸性試驗

液體培養(yǎng)的菌株按1%的接種量接種到pH 2.0(HCl調節(jié))的酸性MRS培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，利用稀釋涂布法計數(shù)，計算菌株成活率，判斷菌株的耐酸性。

1.5.6 糖發(fā)酵試驗

根據(jù)API 50 CHL系統(tǒng)說明書進行操作，將測試菌株于30 ℃分別培養(yǎng)24 h和48 h，而后讀取產酸試驗結果并進行記錄，將結果輸入API plus軟件，初步判定菌種的種屬。

1.5.7 乳酸菌16S rDNA基因序列測定

將篩選的乳酸菌菌株的基因組DNA進行PCR擴增，用1%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測。使用細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3')擴增，PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測定的序列通過BLAST在GenBank中進行同源性比較，并將其鑒定到種。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離和篩選

各種泡菜中所分離出的乳酸菌株數(shù)見表1。從北京、煙臺等4個產地生產的白菜、蘿卜、蘇子葉、豇豆4類泡菜中共分離出45株類似乳酸菌的細菌，其中，煙臺地區(qū)市售散裝泡菜中獲得13株，青島市售泡菜中得到13株，北京地區(qū)泡菜中分離出5株，成都地區(qū)商品化泡菜中獲得14株。

表1 各種泡菜中所分離出的乳酸菌株數(shù)Table 1 The LAB strains isolated from different pickles

續(xù) 表

通過革蘭氏染色后鏡檢觀察菌體形態(tài)，結果顯示：其中36菌株為革蘭氏陽性，不移動，無芽孢生成。其中，33.3%細胞呈橢圓形或圓形，單個、成對或者成串排布；66.7%為桿菌，桿菌排列方式多樣，呈單桿、雙桿或多桿并存的形態(tài)。再將這36株菌進行過氧化氫酶測試，發(fā)現(xiàn)所有菌株均無氣泡產生，即為陰性，因此，初步推斷該36株菌為乳酸菌。并將該36株菌按照其泡菜編號及發(fā)現(xiàn)順序依次命名。

泡菜中乳酸菌的種類與所用的蔬菜原料、腌制方法及腌制時間有關。商軍等從泡蘿卜、泡辣椒和泡白菜中分離出11個乳酸菌株，并對各菌株進行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)不同泡菜中的乳酸菌菌株有明顯差異，泡蘿卜中以短乳桿菌為主，泡辣椒中以短乳桿菌和片球菌為主，泡白菜中以短乳桿菌和鏈球菌為主[8]。據(jù)報道，在泡菜發(fā)酵前期，腸膜明串珠菌和鏈球菌是優(yōu)勢乳酸菌，這些菌株積累有機酸并形成厭氧環(huán)境。進入發(fā)酵中后期，植物乳桿菌和短乳桿菌逐漸成為優(yōu)勢菌群，它們能夠耐受酸性環(huán)境，且不產氣[9]。對于本課題而言，市售的各種泡菜原料可能都處于發(fā)酵中后期，因此分離出的乳酸菌株以桿菌居多。

2.2 乳酸菌發(fā)酵液的pH

將泡菜中分離出的36株乳酸菌在改良的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，跟蹤測定發(fā)酵液的pH變化，試驗結果見表2。有13株菌的菌液pH在3.5～4.0之間，有16株菌的菌液pH處于4.0～4.5之間。其中菌株Q12的菌液pH值最低，為3.79?？傮w而言，所測菌液的pH都處在3.5～5.0之間，平均值為3.94，從而證明這36株乳酸菌的產酸性能均較好。

表2 乳酸菌發(fā)酵液pH分組統(tǒng)計Table 2 pH values of broth resulting from different LAB strains

2.3 降解亞硝酸鹽的菌株的篩選

泡菜制作過程中一般會伴隨亞硝酸鹽含量的逐步增加，給泡菜帶來了安全隱患。乳酸菌能夠降解亞硝酸鹽是由于其含有亞硝酸鹽還原酶，該酶能夠作用于亞硝酸鹽使之分解產生氨[10,11]。將36株乳酸菌株按1%(V/V)接種量接入含125 mg/L的亞硝酸鹽培養(yǎng)液中，30 ℃培養(yǎng)，間隔12 h取樣，測定培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽含量，計算菌株對亞硝酸鈉的降解率。

檢測結果表明，空白組的亞硝酸鹽含量最高，亞硝酸鹽降解率僅為22.5%，說明未接種乳酸菌的試驗組的降解能力較弱。接種乳酸菌菌株的培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽含量均有一定程度的下降，降解率在59.1%～99.8%。不同乳酸菌降解亞硝酸鹽的能力差別較大，其中活性最強的是Y1、Y4、Q6和Q12，接種這4株乳酸菌的培養(yǎng)液的亞硝酸鹽的降解率分別達到98.7%，99.1%，97.9%，99.8%。這4株乳酸菌的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)見表3，亞硝酸鹽降解過程見圖1。

表3 具有高效亞硝酸鹽降解能力的乳酸菌菌落形態(tài)和菌體形態(tài)Table 3 The colonial and cellular morphology of LAB strains capable of nitrite degradation

圖1 4株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中降解亞硝酸鹽的進程Fig.1 The nitrite degradation in the MRS medium inoculated with 4 LAB strains

2.4 耐酸性菌株的篩選

乳酸菌進入人體后需要耐受人體的腸道環(huán)境才能存活并發(fā)揮其益生作用，因此，對于具有乳酸菌而言，不可避免地需要經(jīng)受胃部消化液——胃酸的考驗，因此乳酸菌菌株的耐酸性對于其自身而言非常重要。為考察所篩選菌株的耐酸性，本研究將分離獲得的4株乳酸菌進行耐酸性試驗。在無菌條件下，用接種針挑取分離菌株的菌落于澄清的pH 2.0的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。檢測結果表明，4株乳酸菌各自具有一定的耐酸性，但仍存在較大差異。Y1、Y4、Q6和Q12的成活率分別是21.5%，19.1%，26.5%，44.2%。Q12菌株耐酸性最強，具有應用的潛力。

2.5 糖發(fā)酵試驗

將篩選到的耐酸性較強的Q12進行糖發(fā)酵產酸試驗。根據(jù)API 50 CHL系統(tǒng)說明書進行操作，將Q12在49 種碳水化合物中分別培養(yǎng)24 h和48 h，觀察記錄其產酸結果(見表4)，并利用API plus軟件對結果進行鑒定。試驗結果表明，菌株Q12與植物乳桿菌(66%)和戊糖乳桿菌(34%)的同源性較高。

表4 菌株的API 50 CHL反應結果Table 4 Results of API 50 CHL test reaction

續(xù) 表

2.6 16S rDNA序列測定

對菌株Q12的16S rDNA基因進行PCR擴增，獲得了基因片段(1479 bp)，見圖2。所得擴增產物純化后測序，輸入GenBank中進行同源性比對，結果顯示菌株16S rDNA基因片段與植物乳桿菌同源性均達到99.9%以上，由此可判定菌株Q12為植物乳桿菌(L.plantarum)。

圖2 PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplified electrophoresis

3 結論

乳酸菌是泡菜中的主要微生物，利用其降解亞硝酸鹽的能力可以提高泡菜的食用安全性。本課題從11種市售泡菜中分離獲得了多株乳酸菌，通過革蘭氏染色、過氧化氫酶活性測定，確定其中36株為乳酸菌。對這36株乳酸菌的產酸能力、亞硝酸鹽降解能力和耐酸性進行測試，最終獲得了1株既具有良好耐酸性又具有高效亞硝酸鹽降解活性的菌株。該菌株對亞硝酸鹽的降解率可以達到99.8%，在pH 2.0的MRS培養(yǎng)基中仍可維持44.2%的成活率。隨后對該菌株進行生理生化鑒定和分子生物學鑒定，確定該菌株為植物乳桿菌(L.plantarum)。本研究豐富了乳酸菌菌種資源，并為進一步研究泡菜乳酸菌的功能性及機理以及菌株在泡菜中的應用奠定了基礎。