普通小麥DREB基因家族的全基因組鑒定及熱脅迫下的表達(dá)模式分析

田 文，郭啟平，李梓彰，丁 寧，張 珊，聞珊珊

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是植物最主要的一種提高自身對逆境抵抗能力的方式[1-2]。轉(zhuǎn)錄因子是一種重要的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，它們通過結(jié)合功能基因啟動子區(qū)的順式作用元件來激活或抑制相關(guān)基因的表達(dá)[3]。DREB(dehydration responsive element binding protein)家族是植物中特有的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，是AP2(APETALA2/ethylene-responsive element-binding protein)轉(zhuǎn)錄因子超家族的一個(gè)亞家族。DREB基因在植物對非生物逆境的響應(yīng)中起著重要的作用[4-5]。 CBF1是從擬南芥中克隆到的第一個(gè)植物DREB基因，它能調(diào)節(jié)與冷害和脫水作用有關(guān)的基因的表達(dá)[6]。隨后，在擬南芥中又克隆到了兩個(gè)DREB基因( DREB1和 DREB2)，它們分別參與干旱和低溫條件下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。此后，又從煙草[7]、大麥[8]、水稻[9-10]、小麥[11-13]和大豆[14-15]等多種植物中克隆到了參與干旱、鹽堿和極端溫度等非生物逆境響應(yīng)的DREB基因。同時(shí)，大量的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)或者下調(diào)植物中特定DREB基因的表達(dá)可以提高植物對非生物逆境的抵抗能力[16-18]。目前，已經(jīng)對多種植物中的DREB基因進(jìn)行了全基因組范圍內(nèi)的研究，比如擬南芥[2,19]、水稻[19]、玉米[20]、大麥[21]、棉花[22]和二穗短柄草等[23]。但是有關(guān)小麥中DREB基因家族的全基因組鑒定還未見報(bào)道，這限制了小麥DREB基因的進(jìn)一步發(fā)掘和分析。

近年來，隨著全球氣候變暖，高溫逐漸成為了威脅小麥生長的重要因素。對小麥耐熱基因進(jìn)行研究，可為小麥在高溫條件下穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)提供重要的理論依據(jù)。因此，本研究利用Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)中小麥第34版基因組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法從全基因組范圍內(nèi)鑒定小麥中的DREB基因，并進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析，最后利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)，對小麥DREB基因在不同組織和逆境條件下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，并選取熱脅迫響應(yīng)基因?qū)ζ溥M(jìn)行熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)分析，以期為進(jìn)一步研究DREB基因的功能機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小麥DREB基因家族成員的全基因組鑒定

首先，從Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)在全基因組范圍內(nèi)下載小麥DREB蛋白質(zhì)序列，構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫；從Pfam(http://pfam.xfam.org/)下載已經(jīng)構(gòu)建好的典型AP2保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型(PF00847)，用其作為搜索模型，以E<1e-5為標(biāo)準(zhǔn)，通過HMM 3.0[24]軟件在本地小麥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索能夠匹配此模型的蛋白質(zhì)序列。對于同一個(gè)基因的不同轉(zhuǎn)錄本，只保留長度最長的轉(zhuǎn)錄本作為對應(yīng)基因的蛋白質(zhì)序列。由于AP2轉(zhuǎn)錄因子超家族(由AP2、RAV、ERF和DREB四個(gè)亞家族組成)蛋白質(zhì)序列中都含有AP2保守結(jié)構(gòu)域，因此，經(jīng)過HMM軟件篩選得到的蛋白質(zhì)序列由四個(gè)亞家族成員組成，但是AP2亞家族成員的蛋白質(zhì)序列中包含兩個(gè)串聯(lián)的AP2結(jié)構(gòu)域，RAV亞家族成員的序列中包含一個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)B3保守結(jié)構(gòu)域，ERF和DREB亞家族成員只包含一個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域。因此，將上一步得到的備選序列提交到NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)，分析序列中所含的保守結(jié)構(gòu)域，去除序列中屬于AP2亞家族和RAV亞家族的成員。最后，通過多序列比對，根據(jù)ERF亞家族和DREB亞家族AP2結(jié)構(gòu)域中保守氨基酸的不同，人工去除序列中的ERF基因，最終得到小麥中的DREB基因。使用ExPASy-Compute pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測TaDREB基因編碼蛋白的分子量、氨基酸序列長度和理論等電點(diǎn)；利用CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)預(yù)測TaDREB蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

1.2 基于多序列比對的系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序分析

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)下載擬南芥AtDREB蛋白質(zhì)序列，利用Clustal W軟件對小麥和擬南芥DREB蛋白序列進(jìn)行全局比對，參數(shù)為默認(rèn)。基于多序列比對結(jié)果，利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1000。

通過TaDREB蛋白質(zhì)序列編號和Ensembl Plants中小麥基因組注釋信息，從Ensembl Plants獲得TaDREB基因組序列和CDS序列，然后將序列提交到GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)進(jìn)行外顯子和內(nèi)含子的可視化分析。

用MEME(http://meme-suite.org/)預(yù)測TaDREB蛋白質(zhì)序列的保守基序，并采用如下參數(shù)：(1)最大基序數(shù)量為25；(2)保守基序長度為5～200個(gè)氨基酸；(3)其他參數(shù)為默認(rèn)。

1.3 小麥DREB基因的染色體分布和基因同源復(fù)制分析

利用Ensembl Plants中小麥基因組注釋信息獲得TaDREB基因的染色體位置。參考王萌等[25]的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)TaDREB基因兩兩之間BLASTN比對結(jié)果考察基因同源和復(fù)制事件。將以上分析結(jié)果用Circos 0.67軟件[26]可視化，同源或復(fù)制基因用弧線連接。

1.4 小麥DREB基因互作網(wǎng)絡(luò)、啟動子順式作用元件及基因表達(dá)模式分析

基于小麥和擬南芥中的同源基因，利用AraNet V2(http://www.inetbio.org/aranet/)分析小麥DREB基因參與的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。用Python程序提取TaDREB蛋白質(zhì)編號，通過Ensembl Plants下載TaDREB基因上游1.5 kb序列作為基因的啟動子區(qū)域，并提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測啟動子區(qū)存在的順式作用元件。從WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)下載TaDREB基因在小麥5個(gè)組織(種子、根、莖、葉和穗)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從NCBI Sequence Read Archive(SRA)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)下載TaDREB基因在干旱、熱和旱熱共脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。使用Hisat2軟件[27]和Cuffdiff軟件[28]并按照以下標(biāo)準(zhǔn)鑒定差異表達(dá)基因：(1)對照或處理的FPKM值至少有一個(gè)大于1；(2)log2fold change的絕對值大于1；(3)q值小于0.05。利用Heml軟件繪制表達(dá)譜熱圖。

1.5 熱脅迫響應(yīng)TaDREB基因的qRT-PCR分析

小麥DREB基因在干旱等逆境脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)來源于小麥品種中國春，為鑒定TaDREB基因在不同小麥品種中響應(yīng)非生物脅迫的一致性，以及便于篩選到的熱脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，本研究選取本實(shí)驗(yàn)室用于小麥轉(zhuǎn)基因的品種科農(nóng)199，使用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行TaDREB基因響應(yīng)熱脅迫的驗(yàn)證?？妻r(nóng)199屬于半冬性小麥品種，在本實(shí)驗(yàn)所采用的基因槍轉(zhuǎn)化體系下，科農(nóng)199表現(xiàn)出優(yōu)于其他小麥品種的轉(zhuǎn)化效率，因此本實(shí)驗(yàn)室將科農(nóng)199作為小麥轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證的工具品種。本研究選取科農(nóng)199小麥出苗3 d、7 d、分蘗、春化、起身、拔節(jié)、挑旗、抽穗、開花、灌漿早期、灌漿晚期和成熟期共12個(gè)生長發(fā)育時(shí)期的小麥植株進(jìn)行短期熱脅迫處理，處理溫度分別為35 ℃和42 ℃。用Trizol試劑(生工，上海)提取小麥葉片總RNA，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(羅氏，德國)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。以小麥Actin基因作為內(nèi)參，使用熒光定量試劑Ultra SYBR Mixture(康為世紀(jì)，北京)在Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀(羅氏，德國)上對5個(gè)對熱脅迫有響應(yīng)的TaDREB基因進(jìn)行qRT-PCR(引物見表1)，反應(yīng)體系與程序參考Ultra SYBR Mixture說明書。每個(gè)處理進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品進(jìn)行三次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)處理采用2-△△CT法。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥DREB基因家族成員鑒定結(jié)果

通過HMM軟件的初步搜索，在小麥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中共搜索到595個(gè)能夠匹配AP2結(jié)構(gòu)域隱馬爾科夫模型且E值<1e-5的蛋白質(zhì)序列。將所有序列提交到NCBI-CDD進(jìn)一步篩選后，除去了其中133個(gè)屬于AP2亞家族和RAV亞家族的蛋白質(zhì)序列，剩余的462條蛋白質(zhì)序列均只含有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域且不包含其他保守結(jié)構(gòu)域。將這462條蛋白質(zhì)進(jìn)行多重比對之后，根據(jù)保守區(qū)氨基酸序列，最終確定其中的204條序列屬于DREB基因家族。根據(jù)其系統(tǒng)進(jìn)化分類和染色體位置進(jìn)行命名。根據(jù)ExPASy-Compute pI/Mw的預(yù)測結(jié)果，TaDREB蛋白序列長度為150～1 409 個(gè)氨基酸，分子量為16.5～156.2 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)介于4.29～11.69之間。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，144(70.6%)個(gè)TaDREB蛋白定位在細(xì)胞核中，39個(gè)(19.1%)定位在葉綠體中，16個(gè)(7.8%)定位在細(xì)胞質(zhì)中，3個(gè)(1.5%)定位在質(zhì)膜上，2個(gè)(1.0%)定位在線粒體中。

表1 TaDREB基因qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR analysis of TaDREB genes

2.2 小麥DREB基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序分析

將從NCBI下載的AtDREB和TaDREB蛋白序列一起進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaDREB基因能和AtDREB基因聚到一起，說明小麥中能夠和擬南芥各亞組序列聚到一枝的DREB基因?yàn)橄嗤瑏喗M。根據(jù)聚類結(jié)果，將TaDREB基因分為六個(gè)亞組，分別命名為DREB I、DREB II、DREB III、DREB IV、DREB V和DREB VI。每個(gè)亞組所包含的TaDREB基因數(shù)目分別為68、40、7、42、27和20個(gè)，分別占總數(shù)的33.4%、19.6%、3.4%、20.6%、13.2%和9.8%。

用MEME對TaDREB蛋白質(zhì)保守基序進(jìn)行分析，共鑒定到25個(gè)保守基序，并命名為motif 1～motif 25。結(jié)果表明，保守蛋白質(zhì)基序在不同亞組之間存在高度的保守性。除TaDREB2-7A-1之外，所有的TaDREB蛋白質(zhì)中都含有保守的motif 1，該保守基序位于AP2保守結(jié)構(gòu)域中，并且含有一個(gè)保守的WLG短序列。除此之外，motif 4也幾乎包含在所有(除TaDREB2-5B-3、TaDREB2-5A-1、TaDREB2-4B-2、TaDREB2-2B-3、TaDREB2-2A-2、TaDREB2-2D-3、TaDREB2-6B-2、TaDREB3-1A-1、TaDREB3-1D-1和TaDREB3-1B-1外)的TaDREB蛋白質(zhì)序列中，該保守基序同樣定位在AP2保守結(jié)構(gòu)域中(圖1)。此外，motif 3、motif 4和motif 5在TaDREB蛋白的6個(gè)亞組中均有分布。同時(shí)，不同亞組蛋白質(zhì)保守基序的分布也存在明顯的不同，除DREB III之外，其余5個(gè)亞組均含有其獨(dú)特的保守基序，例如，motif 2、motif 15、motif 12、motif 24和motif 17分別只存在于DREB I、DREB II、DREB IV、DREB V和DREB VI中(圖2)。

對TaDREB基因的結(jié)構(gòu)分析表明，TaDREB基因的內(nèi)含子數(shù)量為0～3個(gè)，存在內(nèi)含子缺失現(xiàn)象。其中，DREB I、DREB III、DREB IV和DREB V等亞組中的大多數(shù)成員均沒有內(nèi)含子，沒有內(nèi)含子的基因數(shù)目分別為63、6、41和24個(gè)，占相應(yīng)亞組基因總數(shù)的比例分別為92.6%、85.7%、97.6%和88.9%，DREB II中所包含的全部40個(gè)基因中，沒有內(nèi)含子的基因只有14個(gè)，占總數(shù)的35%；22個(gè)基因含有一個(gè)內(nèi)含子，占總數(shù)的55%；只有4個(gè)基因含有2～3個(gè)內(nèi)含子。DREB VI中，50%的基因沒有內(nèi)含子，其余50%均含有一個(gè)內(nèi)含子。

2.3 小麥DREB基因的染色體分布和同源復(fù)制分析

根據(jù)Ensembl Plants中小麥基因組注釋信息，本研究將204個(gè)小麥DREB基因中的199個(gè)定位到了染色體上。結(jié)果表明，小麥21條染色體上均有TaDREB基因的分布。從1號到7號染色體，分布的TaDREB基因數(shù)目分別為22、36、11、13、52、41和24個(gè)，其中包含TaDREB基因最多的染色體為5B染色體，其上分布19個(gè)TaDREB基因；而3D染色體上只有3個(gè)TaDREB基因，為最少的一個(gè)，這表明小麥TaDREB基因在不同染色體之間的分布存在不平衡性，這有可能是因?yàn)槿旧w大小及結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的。從同源染色體組的角度來看，小麥A、B和D三個(gè)同源染色體組分別含有61、68和70個(gè)TaDREB基因，這表明A染色體組可能在進(jìn)化的過程中發(fā)生了更多的基因丟失事件。

圖1 小麥DREB蛋白質(zhì)序列保守基序1(A)和保守基序4(B)Fig.1 Conserved motif 1(A) and motif 4(B) in DREB protein

基因同源復(fù)制分析結(jié)果(圖3)表明，有164個(gè)TaDREB基因存在與其高度相似的同源序列，可分為兩類。第一類由108個(gè)TaDREB基因組成，構(gòu)成了36個(gè)同源基因組，每組均由A、B和D染色體組上的三個(gè)同源基因組成；第二類由66個(gè)TaDREB基因組成，形成了33個(gè)同源基因?qū)?，每對同源基因分布在A、B和D三個(gè)同源染色體組中的兩個(gè)上。有趣的是，兩類同源序列中存在10個(gè)基因的重疊。以上結(jié)果說明，雖然小麥中大部分DREB基因都存在高度相似的同源染色體，但仍有一部分基因未鑒定到同源染色體，這表明小麥在進(jìn)化過程中，TaDREB基因發(fā)生了部分丟失。同時(shí)，我們考察了非同源染色體之間基因的復(fù)制事件，總共鑒定到13個(gè)基因復(fù)制事件；其中，7個(gè)復(fù)制事件發(fā)生在同一條染色體上，其余6個(gè)發(fā)生在非同源染色體之間。值得注意的是，13個(gè)基因復(fù)制事件中的5對發(fā)生在5號染色體上。這些結(jié)果表明，在六倍體小麥中，雖然DREB基因復(fù)制事件很少發(fā)生，但是相對于其他染色體，5號染色體上的活躍性更高。

2.4 小麥DREB基因互作網(wǎng)絡(luò)、啟動子順式作用元件和基因表達(dá)模式分析

基于小麥與擬南芥基因的同源性關(guān)系，構(gòu)建了小麥DREB基因與其他基因的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(圖4)?？偣茶b定到了13個(gè)小麥DREB基因與122個(gè)其他基因存在互作關(guān)系，本研究稱這122個(gè)基因?yàn)榛プ骰?，它們共?gòu)成了179個(gè)互作基因?qū)Α＿@些互作基因的功能主要涉及小麥基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、植物的生長發(fā)育和對逆境的響應(yīng)三個(gè)方面。這表明TaDREB基因?qū)π←湹纳L發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。從互作基因角度來看，其中110個(gè)互作基因只與一個(gè)TaDREB基因存在互作關(guān)系。從TaDREB基因的角度來看，TaDREB基因不僅與其他基因存在互作關(guān)系，TaDREB基因之間也存在相互作用關(guān)系。其中，和其他基因相比，與 TaDREB4-6D-1和 TaDREB5-2B-1存在互作關(guān)系的基因最多，分別為42和34個(gè)，并且這些基因的功能涉及器官發(fā)育，轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及熱脅迫等逆境響應(yīng)過程，暗示這兩個(gè)基因在小麥生長發(fā)育過程中的多個(gè)方面同時(shí)起著重要作用。

利用PlantCARE從204個(gè)TaDREB基因啟動子區(qū)共鑒定到了95個(gè)順式作用元件，其中42個(gè)和光響應(yīng)有關(guān)，這表明TaDREB基因的表達(dá)可能和光有緊密的聯(lián)系。MBS(MYB binding site)、LTR(low-temperature responsiveness)和HSE(heat shock element)是在TaDREB基因啟動子區(qū)出現(xiàn)頻率最高的三個(gè)順式作用元件，它們分別涉及干旱、低溫和高溫響應(yīng)。這暗示TaDREB基因可能參與植物對多種逆境的響應(yīng)。

A：motif 2；B：motif 15；C：motif 12；D：motif 24；E：motif 17. 圖2 亞組特異的DREB蛋白質(zhì)保守基序Fig.2 Subgroup-specific conserved motif of DREB protein

從WheatExp下載TaDREB基因在5個(gè)組織中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果(圖5A)表明，TaDREB基因在小麥組織中的表達(dá)存在明顯差異，主要表現(xiàn)為三種表達(dá)模式，分別為在5個(gè)組織中的表達(dá)量都很低，甚至沒有表達(dá)；在5個(gè)組織中的表達(dá)都較高和組織特異性表達(dá)。如 TaDREB5-2B-1和 TaDREB6-6A-1等基因在5個(gè)組織中的表達(dá)量都很高，表明這些基因廣泛參與小麥的生長發(fā)育過程。而 TaDREB1-5B-7和 TaDREB1-5B-8主要在根中表達(dá)，暗示著這兩個(gè)基因在小麥根的發(fā)育中起著重要的作用。除此之外，5個(gè)組織中的每個(gè)組織都有其組織特異性表達(dá)的基因，說明基因表達(dá)的空間特異性在TaDREB基因中同樣存在。

圖3 小麥DREB基因的染色體定位、同源關(guān)系和基因復(fù)制事件Fig.3 Chromosomal localization, homologous relationship and gene duplication events of DREB genes in wheat

z10：第一片葉抽出胚芽鞘時(shí)期；Z10：3葉期；z23：3個(gè)分蘗時(shí)期；z30：穗長為1 cm時(shí)期；z32：2個(gè)節(jié)時(shí)期；z39：減數(shù)分裂時(shí)期；z65：開花期；z71：開花后2天；z75：開花后14天；z85：開花后30天。

z10:First leaf through coleoptile; Z10:Three leaves stage; z23:Three tillers stage; z30:Spike of 1 cm stage； z32：Two nodesstage;z39:Meiosis; z65:Anthesis; z71:2 days after anthesis; z75:14 days after anthesis; z85:30 days after anthesis.

1：干旱脅迫1 h；2：干旱脅迫6 h；3：熱脅迫1 h；4：熱脅迫6 h；5：旱熱共脅迫1 h；6：旱熱共脅迫6 h。

1：Drought for 1 h； 2：Drought for 6 h； 3：Heat for 1 h； 4：Heat for 6 h； 5：Drought plus heat for 1 h； 6：Drought plus heat for 6 h.

圖5小麥DREB基因在不同組織中(A)和不同逆境下(B)的表達(dá)模式分析

Fig.5ExpressionprofilesofTaDREBgenesindifferenttissuesandunderdifferentstresses

同時(shí)為了考察TaDREB基因在不同的非生物逆境條件下的表達(dá)模式，本研究下載了NCBI中現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過分析發(fā)現(xiàn)，在干旱、熱和旱熱共脅迫條件下，共有29個(gè)TaDREB基因在至少一種逆境條件下表現(xiàn)出了差異表達(dá)(圖5B)。在干旱脅迫下，11個(gè)基因的表達(dá)量顯著升高，5個(gè)基因的表達(dá)量顯著降低；熱脅迫下，15個(gè)基因的表達(dá)量顯著升高，8個(gè)基因的表達(dá)量顯著降低；在二者共脅迫下，16個(gè)基因的表達(dá)量顯著升高，10個(gè)基因的表達(dá)量顯著降低。值得注意的是， TaDREB4-7D-1在熱脅迫下表達(dá)量升高了100倍， TaDREB6-4D-1在干旱下的表達(dá)量上升了271倍， TaDREB6-2B-1在旱熱共脅迫條件下的表達(dá)量上升了189倍，暗示這些基因可能在對應(yīng)的非生物逆境的響應(yīng)中起著重要的作用。

2.5 熱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)模式分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，本研究選擇了5個(gè)對熱脅迫響應(yīng)程度最高的TaDREB基因，在小麥品種科農(nóng)199中使用qRT-PCR驗(yàn)證這種響應(yīng)。結(jié)果表明(圖6)，整體來看，這5個(gè)基因在小麥12個(gè)生育時(shí)期中的絕大部分時(shí)期都對熱脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，表達(dá)量均顯著升高。如 TaDREB2-1B-1基因，在12個(gè)生育時(shí)期中的6個(gè)時(shí)期，以及在42 ℃處理下，在12個(gè)時(shí)期中的7個(gè)時(shí)期，表達(dá)量均顯著升高。 TaDREB2-7A-2基因在35 ℃處理下，在12個(gè)時(shí)期的11個(gè)中表達(dá)量都顯著升高。值得注意的是，小麥DREB基因的表達(dá)對42 ℃脅迫的響應(yīng)沒有對35 ℃脅迫顯著，在很多發(fā)育階段，DREB基因?qū)?2 ℃脅迫并無響應(yīng)，基因表達(dá)沒有顯著變化。暗示著5個(gè)基因可能并不是小麥的42 ℃脅迫下的主要響應(yīng)基因。但是從總體來看，對這5個(gè)基因的qRT-PCR分析結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致，暗示這5個(gè)基因在小麥的高溫脅迫響應(yīng)中扮演著重要角色。

X軸上的1～12依次代表小麥出芽3天、出芽7天、分蘗期、春化期、起身期、拔節(jié)期、挑旗期、抽穗期、開花期、灌漿早期、灌漿晚期和成熟期。

1-12 on the X-axis represent the 12 growth periods of wheat including 3 days and 7 days after germination, tillering, vernalization, booting, jointing, flagging, heading, flowering, early grain filling, late filling and maturing stages,respectively.

圖65個(gè)熱響應(yīng)基因在小麥品種科農(nóng)199不同生長發(fā)育時(shí)期的相對表達(dá)水平

Fig.6Relativeexpressionoffiveheatresponsegenesin12growthperiodsofwheat

3 討 論

本研究在小麥全基因組范圍內(nèi)鑒定TaDREB基因，并最終獲得了204個(gè)TaDREB基因，大約占小麥中所有編碼基因的0.195%，這個(gè)比例和擬南芥中的0.206%接近，高于水稻的0.160%和玉米的0.129%。從數(shù)量來看，TaDREB基因的數(shù)量高于擬南芥(57)、水稻(57)和玉米(51)，這很可能和它龐大的基因組有關(guān)；小麥屬于異源六倍體，是由三個(gè)物種通過雜交和染色體加倍形成的，在此過程中，基因數(shù)目也自然而然發(fā)生了加倍。值得注意的是，本研究鑒定到的TaDREB基因中，有16個(gè)TaDREB基因的編碼蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，這有可能是軟件的預(yù)測誤差和小麥基因組注釋誤差造成的。

針對DREB基因的全基因組鑒定最早是在擬南芥中進(jìn)行的，Sakuma等[2]根據(jù)DREB蛋白質(zhì)序列的不同將該家族分為6個(gè)亞組，隨后在其他物種DREB基因的全基因組鑒定中，延續(xù)了這種分類標(biāo)準(zhǔn)，并采用將待研究物種DREB蛋白質(zhì)序列與擬南芥DREB蛋白質(zhì)序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并根據(jù)聚類結(jié)果對所研究物種DREB基因進(jìn)行分類的方法。但是由于算法的原因，這種分類方法存在微小的誤差。為避免這種誤差造成的累積誤差，本研究中只使用擬南芥DREB蛋白序列與小麥DREB蛋白序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，而沒有加入其他物種的DREB蛋白質(zhì)序列。蛋白質(zhì)保守基序分析表明，亞組內(nèi)部蛋白質(zhì)保守基序分布高度相似，不同亞組之間存在明顯的不同，這從另一個(gè)方面證明了上述分類方法的正確性。最后，基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，TaDREB基因普遍缺少內(nèi)含子，這種現(xiàn)象和其他物種中的DREB基因結(jié)構(gòu)類似。一種解釋基因中內(nèi)含子缺少現(xiàn)象的推測認(rèn)為，內(nèi)含子的缺失能夠減少基因從轉(zhuǎn)錄到翻譯所需要的時(shí)間，使基因快速表達(dá)并生成有功能的蛋白質(zhì)，以響應(yīng)植物體內(nèi)或環(huán)境的變化[29]。

啟動子分析表明，小麥DREB基因涉及對光、干旱和熱脅迫等多種逆境的響應(yīng)；基因互作表明，小麥TaDREB基因主要通過與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的互作來發(fā)揮其生物學(xué)功能。兩種分析均表明，TaDREB基因的不同成員在小麥的生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，是小麥生長發(fā)育中不可缺少的重要因素。

為了進(jìn)一步研究DREB基因在小麥生長發(fā)育和逆境脅迫條件下的潛在作用，本研究下載并分析了TaDREB基因在小麥組織和逆境條件下的表達(dá)情況，鑒定到了一些組織特異表達(dá)基因，說明不同的TaDREB基因可能參與不同小麥組織的生長發(fā)育，基因表達(dá)有明顯的空間特異性。同時(shí)，也鑒定到多個(gè)對逆境脅迫有響應(yīng)的基因，例如， TaDREB4-7D-1、 TaDREB6-4D-1和 TaDREB6-2B-1在逆境脅迫條件下表達(dá)量顯著上調(diào)，通過分子生物學(xué)和基因工程等手段對這這些基因的進(jìn)一步研究，將為小麥在不良環(huán)境下的生理代謝機(jī)制提供新的信息，并為其他物種中DREB基因的研究提供線索和思路。