hTERT啟動子介導的PRPS2基因表達下調(diào)對膠質(zhì)瘤U251細胞增殖和凋亡的影響

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膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，約占顱內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤的50%～60%，是最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤[1]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)的治療手段主要包括手術(shù)、放療、化療。然而，膠質(zhì)瘤的浸潤性生長、對放化療的耐受性使得膠質(zhì)瘤的整體治療效果欠佳[2]。磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)基因是編碼體內(nèi)嘌呤、嘧啶兩種核苷酸從頭合成、補救合成的關(guān)鍵酶基因。通過下調(diào)PRPS2基因表達，進而抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，有望成為膠質(zhì)瘤基因治療的新思路[3]。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因啟動子具有高腫瘤靶向性及較強的啟動活性，從而成為腫瘤靶向基因治療中具有巨大潛力的啟動子[4]。本研究擬通過hTERT啟動子介導，利用RNAi技術(shù)下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞中PRPS2基因表達，研究其增殖、凋亡等生物學特性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人膠質(zhì)瘤U251細胞由本室保存；pGGN-hTERT-PRPS2干擾載體購自上海吉瑪基因化學技術(shù)有限公司；胎牛血清購自四季青公司；DMEM購自GIBCO公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自Promega公司；Effectene Transfection Reagent購自QIAGEN公司；Cell Counting Kit8細胞增殖(CCK-8)試劑盒、Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司；Hoechst 33342購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 RT-PCR檢測 采用RT-PCR方法檢測干擾載體對U251細胞中PRPS2的mRNA水平的影響。取RNA 2 μg，5×PrimeScript Buffer 4 μL，加RNase Free dH2O至總體積20 μL，37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。PCR 擴增人PRPS2基因，上游引物為：5′- GATTGCGTCATCATCCAG AGT-3′；下游引物為：5′- CATTCGCCTTCTTCCTCTCT T-3′。引物由上海生工公司合成。反應條件為：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30 個循環(huán)。

1.3 細胞培養(yǎng) 人類膠質(zhì)瘤細胞系U251細胞由實驗室保存，含10%胎牛血清的Gibco高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2、相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%的胰酶消化，每2 d換液傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.4 轉(zhuǎn)染 參考說明書進行細胞轉(zhuǎn)染。設(shè)空白對照組(無干預)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染pGGN-hTERT-PRPS2-C載體)和實驗組(轉(zhuǎn)染pGGN-hTERT-PRPS2-si載體)。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖能力 采用CCK-8實驗檢測PRPS2表達改變對細胞增殖能力的影響。將 96孔板每孔接種100 μL，約2 000個細胞。轉(zhuǎn)染72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，用酶標儀檢測A450。

1.6 Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡與壞死 采用Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡與壞死情況。在6孔板中，每孔接種1×106個細胞。轉(zhuǎn)染72 h后，每孔加入5 μL Hoechst 33342染色液，混勻，4 ℃染色20 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗1次，熒光顯微鏡觀察。

1.7 Annexin V/PI檢測細胞凋亡與壞死 采用Annexin V/PI檢測細胞凋亡與壞死情況。用不含EDTA的胰酶消化收集細胞；用PBS洗滌細胞2次(1 000 r/min離心5 min)收集1×105～5×105細胞；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-EGFP混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應15 min；流式細胞儀檢測。

1.8 細胞周期分布檢測 通過流式細胞儀采用PI染色檢測細胞周期的變化。首先，用胰酶消化收集細胞；用PBS洗滌細胞2次，常溫2 000 r/min離心5 min后收集1×106細胞；棄去上清，加入1.5 mL PBS，拍打成細胞懸液，加預冷的70%乙醇；4 ℃固定過夜；1 500 r/min離心5 min，棄去上清，PBS沖洗后加入100 μL RNase A，37 ℃水浴保溫30 min，再加入400 μL PI染色液混勻，4 ℃避光30 min，使用流式細胞儀進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 干擾載體對U251細胞PRPS2表達的影響 分別將PRPS2干擾載體轉(zhuǎn)染U251細胞72 h后，收集并分別提取總RNA和總蛋白。RT-PCR檢測細胞內(nèi)PRPS2 mRNA的表達，結(jié)果顯示，陰性對照組細胞中PRPS2相對表達量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而實驗組細胞中PRPS2的相對表達量較陰性對照組明顯下降(0.39±0.05與0.99±0.09，t=-13.21，P<0.05)。詳見圖1。

A為空白對照組；B為陰性對照組；C為實驗組。與陰性對照組比較，*P<0.05

2.2 PRPS2表達下調(diào)對U251細胞增殖能力的影響 采用CCK-8檢測細胞增殖能力。結(jié)果顯示，陰性對照組細胞活性與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組與陰性對照組相比，U251細胞活性明顯降低(P<0.01)。實驗組在轉(zhuǎn)染48 h后細胞活性降低15.5%，轉(zhuǎn)染72 h后降低16.1%，說明PRPS2表達下調(diào)對U251細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。詳見表1。

表1 PRPS2表達下調(diào)對U251細胞增殖能力的影響(±s)

2.3 PRPS2表達下調(diào)對U251細胞凋亡的影響 Hoechst33342細胞染色結(jié)果顯示，空白對照組、陰性對照組細胞核呈均勻淡色，而實驗組細胞核出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變，細胞核染色質(zhì)高度聚集，可見亮藍色小點，有的甚至亮到發(fā)白，有的出現(xiàn)核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體。詳見圖2。進一步采用Annexin V/PI雙染色法對細胞凋亡情況進行定量。結(jié)果顯示，陰性對照組細胞凋亡率與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義[(18.41±1.60)% 與(17.93±1.79)%，t=0.44，P>0.05]；實驗組細胞凋亡率為(27.16±1.57)%，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=8.70，P<0.05)，說明下調(diào)PRPS2基因的表達可顯著增加U251細胞的凋亡。詳見圖3。

A為空白對照組；B為陰性對照組；C為實驗組

A為空白對照組；B為陰性對照組；C為實驗組。與陰性對照組比較，*P<0.05

2.4 PRPS2表達下調(diào)對U251細胞周期的影響 分別將PRPS2干擾載體轉(zhuǎn)染U251細胞72 h后進行PI染色后，通過流式細胞儀檢測細胞周期的變化。結(jié)果顯示，陰性對照組與空白對照組比較，各個階段細胞數(shù)量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，PRPS2基因表達下調(diào)后，U251細胞的周期發(fā)生明顯變化，G1期細胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)，S期細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，G2/M期差異無統(tǒng)計學意義。說明PRPS2基因低表達能夠?qū)е耈251細胞阻滯于G0/G1期，細胞分裂減緩。詳見表2、圖4。

表2 PI染色檢測下調(diào)PRPS2表達對U251細胞周期的影響(±s) %

A為空白對照組；B為陰性對照組；C為實驗組

圖4 PI染色檢測PRPS2表達下調(diào)對U251細胞周期的影響

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有高發(fā)病率、復發(fā)率、死亡率和低治愈率的特點。因為傳統(tǒng)手術(shù)、放化療等治療手段的局限性，所以從分子機制角度研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，為臨床提供新的治療策略就顯得尤為重要。文志華等[5]研究發(fā)現(xiàn)花生四烯酸乙醇胺可通過神經(jīng)酰胺從頭合成通路，與神經(jīng)酰胺呈濃度依賴性協(xié)同作用，從而抑制人膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖并誘導其早期凋亡。薛歡鴿等[6]通過siRNA靶向沉默ABCE1基因，可顯著降低U251細胞的增殖和遷移能力。朱虹帆等[7]發(fā)現(xiàn)人膠質(zhì)瘤組織細胞較正常腦組織CEP55表達明顯增高，抑制CEP55的表達可抑制人膠質(zhì)瘤251細胞的增殖，同時促進人膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。陳照亮等[8]利用miR-592通過直接靶向Runx2來誘導神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡，進而抑制細胞的生長。

PRPS2編碼的PRPP是體內(nèi)嘌呤、嘧啶從頭合成和補救合成的重要底物，同時也是該通路上的重要調(diào)節(jié)因子，在細胞增殖中發(fā)揮重要作用[9]。阻斷腫瘤細胞核苷酸的合成也是目前臨床廣泛應用的抗代謝類腫瘤化療藥物的作用機制。阻斷PRPS2的表達可有效阻斷增殖較快的組織中核苷酸從頭合成途徑，進而阻斷腫瘤細胞的增殖。陳穎等[10]下調(diào)宮頸癌hela細胞中PRPS2基因的表達后，發(fā)現(xiàn)hela細胞活性及增殖能力降低、細胞遷移能力下降。Xue等[11]研究神經(jīng)母細胞瘤發(fā)病機制中關(guān)鍵驅(qū)動基因MYCN，發(fā)現(xiàn)PRPS2與SDC1共同受到MYCN和TFAP4調(diào)控后參與神經(jīng)病母細胞瘤的增殖及轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞的新陳代謝與正常細胞不同，Burkhart等[12]對腫瘤細胞在腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變時代謝相關(guān)分子機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)HUR在胰腺癌細胞對抗缺糖損傷時的應激性新陳代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而PRPS2是HUR調(diào)控的關(guān)鍵靶點之一，與HUR的表達呈正相關(guān)。

hTERT啟動子在正常細胞中無活性，而在腫瘤細胞中有顯著活性。利用hTERT啟動子構(gòu)建腫瘤細胞特異性表達載體，并將其利用在腫瘤基因靶向治療中，有良好的腫瘤特異性和安全性，對腫瘤細胞的凋亡和腫瘤的抑制有良好的效果[13]。諸多研究利用hTERT啟動子介導不同目的基因的表達，研究其對腫瘤的作用。Jacob等[14]通過構(gòu)建hTERT啟動子介導調(diào)控TNF相關(guān)凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)基因表達載體，僅在卵巢癌細胞中發(fā)揮作用，而不會對正常細胞產(chǎn)生影響，特異性干擾促進卵巢癌細胞發(fā)生凋亡。Li等[15]構(gòu)建了hTERT啟動子介導調(diào)控TRAIL基因的腺病毒載體和巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子介導調(diào)控TRAIL基因的腺病毒載體，并在體內(nèi)、體外進行實驗，發(fā)現(xiàn)hTERT啟動子的啟動能力略微低于巨細胞病毒啟動子，但是其對正常細胞無影響，而促進了人膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。Kalinichenko等[16]將hTERT啟動至與antioxidant response element (ARE) 相結(jié)合，增強了NRF-2轉(zhuǎn)錄因子腫瘤細胞中的轉(zhuǎn)錄活性，進一步提升了5-氟尿嘧啶對肺癌細胞的殺傷特異性。

上述研究與本研究有良好的一致性，證明利用hTERT啟動子構(gòu)建腫瘤細胞特異性表達載體在腫瘤基因靶向治療中有良好的應用前景，該方法有望成為腫瘤治療的新靶點。本研究利用RNAi技術(shù)，通過hTERT啟動子介導PRPS2表達下調(diào)，與對照組相比，細胞活力明顯降低，細胞凋亡明顯增高。由此可見，PRPS2在膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖中發(fā)揮著重要的促進作用。在細胞周期的檢測中，PRPS2表達下調(diào)后，U251細胞發(fā)生G0/G1期阻滯。

利用hTERT啟動子構(gòu)建PRPS2下調(diào)載體在膠質(zhì)瘤基因靶向治療中，有良好的應用前景，該方法有望為膠質(zhì)瘤治療提供新的思路。