電針調(diào)控慢性腦灌流不足大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的Noggin/BMP4機(jī)制研究

， ，，

慢性腦供血不足是由各種原因?qū)е麓竽X出現(xiàn)慢性灌注不足，從而引發(fā)大腦缺血、缺氧出現(xiàn)的腦功能障礙的疾病。而學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降是腦供血不足主要臨床表現(xiàn)之一。諸多臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，針灸治療可以明顯改善腦供血及學(xué)習(xí)記憶能力，但對(duì)其分子機(jī)制的研究至今還不明確。

本研究采用雙血管阻斷法(2-VO)造成慢性腦灌注不足大鼠模型，從調(diào)節(jié)腦與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)的神經(jīng)誘導(dǎo)因子Noggin及其拮抗劑骨結(jié)合蛋白-4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)的表達(dá)為切入點(diǎn)，觀(guān)察慢性腦缺血大鼠及電針治療時(shí)海馬新生細(xì)胞的增殖、分化等神經(jīng)發(fā)生的變化規(guī)律，探討Noggin與BMP4在電針治療中對(duì)神經(jīng)發(fā)生的影響，以期待從神經(jīng)生物學(xué)角度闡明針灸治療慢性腦缺血損傷疾病作用機(jī)制，為針灸治療腦缺血疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 實(shí)驗(yàn)用3個(gè)月齡雄性SD大鼠108只，體重210 g±30 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組與手術(shù)組，造模后將手術(shù)組隨機(jī)分為模型組與電針組，然后將假手術(shù)組、模型組、電針組大鼠再按缺血1周、2周、4周分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組12只。

1.2 動(dòng)物模型制備 按Ni等[1]方法永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈制作慢性腦灌注不足大鼠模型。大鼠稱(chēng)重后用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，暴露頸部，局部備皮，用聚維酮碘(PV)消毒后行頸部正中切開(kāi)術(shù)，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，后用4#縫合線(xiàn)結(jié)扎，確保阻斷動(dòng)脈血流，縫合切口。

1.3 電針治療方法 自制捕鼠器固定大鼠頭部，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[2]中大鼠穴位定位方法取“百會(huì)”和“大椎”穴，用0.5寸針灸針針刺穴位，“百會(huì)”穴刺法：從“百會(huì)”穴沿頭頂正中線(xiàn)向后斜平刺0.5 cm；“大椎”穴刺法：直刺0.5 cm。將韓氏穴位神經(jīng)刺激儀的輸出線(xiàn)連接兩穴位針灸針，調(diào)節(jié)刺激參數(shù)：輸出電流1 mA，頻率15 Hz連續(xù)波，時(shí)間20 min。大鼠頭部一般會(huì)出現(xiàn)輕微抖動(dòng)，每天1次，治療7次后休息1 d。

1.4 細(xì)胞標(biāo)記及取材方法 B5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記：各組大鼠每組隨機(jī)抽取6只，在術(shù)后第4天進(jìn)行BrdU腹腔注射，連續(xù)注射3 d，每日2次(間隔12 h)，以觀(guān)察新生細(xì)胞增殖、分化情況。按不同要求處死大鼠后取材，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。取材方法：①取標(biāo)記BrdU的大鼠(取BrdU標(biāo)記者，每組6只)，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用生理鹽水經(jīng)左心室、升主動(dòng)脈灌注，直至流出液為澄清液體，接著推注4%多聚甲醛(用0.1 mol/L磷酸緩沖液配制成pH7.4溶液)200 mL。隨后滴注4%多聚甲醛500 mL，先快滴后慢滴。然后開(kāi)顱，迅速將腦組織完整取出，置于4%多聚甲醛液中固定，4 ℃浸泡24 h；繼以移入20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，標(biāo)本沉底后取出，錫箔紙包裹液氮速凍4 min，-80 ℃保存，以備制作冰凍切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察。②預(yù)先將實(shí)驗(yàn)室空調(diào)打開(kāi)(18 ℃，4 h)，然后將實(shí)驗(yàn)大鼠(每組剩余6只)麻醉后，放置在冰臺(tái)上斷頭取腦，分離腦組織，取出海馬，然后放入2 mL的離心管中，迅速置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存，以備RT-PCR半定量檢測(cè)之用。

1.5 BrdU免疫組化染色方法及細(xì)胞計(jì)數(shù) 將切片入50%甲酰胺2×SSC中，置于64 ℃孵育箱30 min，入2 mol/L HCl中，37 ℃孵育30 min，每步之間漂洗。用過(guò)氧化物酶染法進(jìn)行BrdU染色，正常兔血清常溫封閉1 h，甩去血清，繼之入一抗(一抗為Rat Anti-BrdU單克隆抗體，Abcam 公司提供)4 ℃濕盒孵育過(guò)夜，入二抗[二抗為Ribbt Anti-RatIgG (H+L)(HRP)， Abcam 公司提供]常溫1 h，繼之DAB顯色5 min～8 min，蘇木素復(fù)染40 s，脫水封片。

陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)取連續(xù)計(jì)數(shù)3個(gè)相鄰視野海馬顆粒細(xì)胞層(granular cell layer，GCL) BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2)，每只大鼠細(xì)胞數(shù)量來(lái)自6張切片的均數(shù)。

1.6 免疫熒光雙標(biāo)染色方法及細(xì)胞計(jì)數(shù) 0.01 mol/L檸檬酸緩沖液高火微波煮沸，置片后中低火微波處理3 min，間隔5 min，反復(fù)3次后，降至室溫，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，此后每步之間漂洗。入2N HCl中，37 ℃孵育30 min。正常兔血清封閉1 h，甩去血清，按比例將GFAP或NeuN(兩種抗體均為小鼠單克隆抗體由Chemicon公司提供)與BrdU一抗混合稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜，將異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的第一個(gè)二抗[Ribbt Anti-RatIgG (H+L)(FITC)：Abcam 公司提供]稀釋后加入，37 ℃避光1 h孵育，將花青(cyanine，Cy3)標(biāo)記的第2個(gè)二抗[Ribbt Anti-Mouse IgG (H+L)(Cy3)，Chemicon 公司提供]稀釋后加入，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗，緩沖甘油封片。

增殖細(xì)胞計(jì)數(shù)分別在不同激發(fā)光(LEICA DML2500熒光顯微鏡，F(xiàn)ITC為綠熒光，A：495 nm，E：528 nm；Cy3，A：450 nm，E：570 nm為紅熒光)下觀(guān)察并攝片，并用合成軟件合成。連續(xù)取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及BrdU+GFAP、BrdU+NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，因BrdU+NeuN雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較少，為避免誤差，只對(duì)BrdU單標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞、BrdU+GFAP雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞、BrdU+NeuN雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別以平均每平方毫米含多少個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)算海馬GCL單位面積內(nèi)的BrdU數(shù)及BrdU熒光雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，然后計(jì)算熒光雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞(分化細(xì)胞)占海馬新生神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)的比例，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每只大鼠細(xì)胞數(shù)量來(lái)自6張切片的均數(shù)。

1.7 RT-PCR檢測(cè)方法 取出保存的海馬每只10 mg，共60 mg加入1 mL TriBlue，提取總RNA，按文獻(xiàn)[3]提供方法進(jìn)行。取總RNA 2 μg，加入DEPC-H2O使總體積為8 μL，加入0.5 μL Ribonuclease inhibitor，2 μL Random Primer，混勻后65 ℃保溫5 min，室溫放置10 min，離心，將所有溶液收集于管底；加入 4 μL 5×First-strand Buffer、0.5 μL Ribonuclease inhibitor、2 μL 100 mol/L MDTT、2 μL dNTP mix、1 μL MMLV Reverse Trariptase；混勻并離心，37 ℃保溫1 h。 90 ℃處理5 min，冰上冷卻10 min，室溫離心，將所有溶液收集到管底，按2 μL/PCR管分裝。通過(guò)網(wǎng)站(www.genome.wi.mit.edu)提供的引物設(shè)計(jì)程序(Primer 5.0)，設(shè)計(jì)PCR引物。Noggin上游5′-AGCACCCAGCGACAACCT-3′，下游5′-GCCACATCTGTAACTTCCTCCT-3′；BMP4上游5′-TGGACACCTCATCACACGACTA-3′，下游5′-GCGACGGCAGTTC TTATTCTTC-3′；β-actin上游5′-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3′，下游5′-AC AGAGTACTTGCGCTCAGG A-3′。擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板2 μL，100 μmol/L上游引物0.5 μL，100 μmol/L下游引物0.5 μL，Taq酶0.7 μL，dNTP 1 μL，Mg2+free Buffer緩沖液5 μL，MgCl25 μL，DDW補(bǔ)充至50 μL，混勻離心，放入PCR儀中擴(kuò)增(擴(kuò)增參數(shù)見(jiàn)表1)。反應(yīng)產(chǎn)物置1.6 %瓊脂糖凝膠電泳，攝片，掃描半定量。

表1 擴(kuò)增參數(shù)

2 結(jié) 果

2.1 海馬NSC的增殖情況 缺血1周、2周，電針組與模型組大鼠海馬齒狀回顆粒下層BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增多(P<0.01)，而缺血4周時(shí)電針組、模型組、假手術(shù)組海馬齒狀回顆粒下層BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。缺血1周、2周，電針組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯增多(P<0.05或P<0.01)；缺血4周時(shí)電針組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，電針組與模型組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈遞減趨勢(shì)，假手術(shù)組變化趨勢(shì)不明顯。詳見(jiàn)表2。BrdU免疫組化詳見(jiàn)圖1。

表2 各組不同時(shí)間海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(±s) 個(gè)/mm2

2.2 海馬NSC的分化情況

2.2.1 BrdU+NeuN免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果 造模后2周，海馬GCL開(kāi)始有少量BrdU+NeuN雙表達(dá)細(xì)胞，第4周BrdU+NeuN雙表達(dá)細(xì)胞所占比例增加(P<0.01)。缺血2周時(shí)，假手術(shù)組、模型組與電針組BrdU+NeuN雙表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。缺血4周時(shí)，模型組與假手術(shù)組BrdU+NeuN雙表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；電針組BrdU+NeuN雙表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組、模型組明顯增多(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。BrdU+NeuN熒光雙標(biāo)圖詳見(jiàn)圖2、圖3。

圖1 BrdU免疫組化(40×)

表3 BrdU+NeuN免疫熒光雙標(biāo)法NeuN陽(yáng)性細(xì)胞率比較(±s) 10-2

所有熒光雙標(biāo)圖片均在熒光顯微鏡10×40倍下拍攝，圖A發(fā)綠色熒光者為FITC標(biāo)記；圖B發(fā)紅熒光為Cy3標(biāo)記，圖C為圖A、圖B的合成圖，表示兩種物質(zhì)共表達(dá)，上圖箭頭指示者為陽(yáng)性細(xì)胞

圖2缺血2周各組BrdU+NeuN熒光雙標(biāo)結(jié)果

所有熒光雙標(biāo)圖片均在熒光顯微鏡10×40倍下拍攝，圖A發(fā)綠色熒光者為FITC標(biāo)記；圖B發(fā)紅熒光為Cy3標(biāo)記，圖C為圖A、圖B的合成圖表示兩種物質(zhì)共表達(dá)，上圖箭頭指示者為陽(yáng)性細(xì)胞。

圖3缺血4周各組BrdU+NeuN熒光雙標(biāo)結(jié)果

2.2.2 BrdU+GFAP免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果 造模2周后，海馬GCL開(kāi)始有少量BrdU+GFAP雙表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，第4周BrdU+GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例增加(P<0.01)。缺血2周時(shí)，電針組、模型組、假手術(shù)組BrdU+GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。缺血4周時(shí)，與假手術(shù)組比較，模型組與電針組BrdU+GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例均明顯增高(P<0.05)，但4周電針組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表4。BrdU+GFAP熒光雙標(biāo)圖詳見(jiàn)圖4、圖5。

表4 BrdU+GFAP免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果法GFAP陽(yáng)性細(xì)胞率比較(±s) 10-2

2.3 海馬組織Noggin與BMP4 mRNA的表達(dá)情況

2.3.1 Noggin mRNA相對(duì)表達(dá)量 缺血1周、2周，模型組Noggin mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，缺血4周時(shí)模型組Noggin mRNA相對(duì)表達(dá)量與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。缺血1周、2周、4周，電針組Noggin mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。模型組Noggin mRNA相對(duì)表達(dá)量隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì)，4周時(shí)與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。電針組呈現(xiàn)持續(xù)高表達(dá)，缺血2周時(shí)最高。詳見(jiàn)表5、圖6。

所有熒光雙標(biāo)圖片均在熒光顯微鏡10×40倍下拍攝，圖A發(fā)綠色熒光者為FITC標(biāo)記；圖B發(fā)紅熒光為Cy3標(biāo)記，圖C為圖A、圖B的合成圖，表示兩種物質(zhì)共表達(dá)，上圖箭頭指示者為陽(yáng)性細(xì)胞

圖4缺血2周各組BrdU+GFAP熒光雙標(biāo)圖

所有熒光雙標(biāo)圖片均在熒光顯微鏡10×40倍下拍攝，圖A發(fā)綠色熒光者為FITC標(biāo)記；圖B發(fā)紅熒光為Cy3標(biāo)記，圖C為圖A、圖B的合成圖，表示兩種物質(zhì)共表達(dá)，上圖箭頭指示者為陽(yáng)性細(xì)胞

圖5 缺血4周各組BrdU+GFAP熒光雙標(biāo)圖

A為假手術(shù)組缺血1周；B為模型組缺血1周；C為電針組缺血1周；D為假手術(shù)組缺血2周；E為模型組缺血2周；F為電針組缺血2周；G為假手術(shù)組缺血4周；H為模型組缺血4周；I為電針組缺血4周

圖6大鼠海馬Noggin、β-actin電泳圖

2.3.2 BMP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量 缺血1周、2周、4周，模型組BMP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較假手術(shù)組顯著增加(P<0.01)，電針組BMP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組明顯降低(P<0.05)。假手術(shù)組隨時(shí)間變化不明顯。造模后，模型組與電針組BMP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高；且模型組隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)；電針組在缺血1周、2周呈下降趨勢(shì)，4周時(shí)略有升高。詳見(jiàn)表6、圖7。

表6 各組不同時(shí)間海馬BMP4 mRNA的表達(dá)(±s)

A為假手術(shù)組缺血1周；B為模型組缺血1周；C為電針組缺血1周；D為假手術(shù)組缺血2周；E為模型組缺血2周；F為電針組缺血2周；G為假手術(shù)組缺血4周；H為模型組缺血4周；I為電針組缺血4周

圖7大鼠海馬BMP4、β-actin電泳圖

2.3.3 Noggin與BMP4相對(duì)表達(dá)量比值變化 缺血1周、2周、4周，模型組Noggin與BMP4相對(duì)表達(dá)量比值與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，電針組Noggin與BMP4相對(duì)表達(dá)量比值與假手術(shù)組、模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。模型組4周時(shí)Noggin與BMP4相對(duì)表達(dá)量比值明顯低于1周時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與假手術(shù)組Noggin與BMP4相對(duì)表達(dá)量比值隨時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。詳見(jiàn)表7。

表7 各組不同時(shí)間Noggin與BMP4相對(duì)表達(dá)量比值變化(±s)

3 討 論

以往一直認(rèn)為成年動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元是終極分化細(xì)胞，一旦因疾病或損傷導(dǎo)致死亡后不會(huì)再生；在成年哺乳動(dòng)物大腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不能產(chǎn)生足夠的神經(jīng)細(xì)胞來(lái)替代這些損傷細(xì)胞，由此使神經(jīng)回路的完整性破壞[4]。然而，自從Altman等[5]首次發(fā)現(xiàn)成年嚙齒動(dòng)物腦內(nèi)有神經(jīng)發(fā)生后，研究者一直致力于研究整個(gè)哺乳動(dòng)物種類(lèi)，包括人類(lèi)在內(nèi)的成年海馬齒狀回產(chǎn)生的新的神經(jīng)細(xì)胞及其作用[6]。海馬是目前公認(rèn)的與學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)神經(jīng)功能活動(dòng)有密切關(guān)系的重要腦區(qū)，缺血對(duì)海馬的損傷是認(rèn)知功能障礙的主要病理基礎(chǔ)。目前研究發(fā)現(xiàn)，新生及成年哺乳動(dòng)物的海馬區(qū)域可持續(xù)產(chǎn)生NSC，而NSC在特定的微環(huán)境中調(diào)控因子影響的情況下可增殖、分化、遷移為特殊的神經(jīng)細(xì)胞表型，從而功能性地整合到海馬回路中起作用，這為深入研究海馬功能及進(jìn)一步探討針刺防治缺血性疾病提供了新的途徑。

BrdU是一個(gè)胸腺嘧啶類(lèi)似物，它的應(yīng)用是這一領(lǐng)域革命性的突破，采用BrdU標(biāo)記的方法，可以發(fā)現(xiàn)成年海馬齒狀回中的神經(jīng)發(fā)生，從而打破了“神經(jīng)發(fā)生僅存在于胚胎中”的傳統(tǒng)觀(guān)念[7]。BrdU能整合到處于細(xì)胞分裂周期S期的DNA雙鏈中，并可通過(guò)免疫組化熒光染色，檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)的變化，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞可被看作是具有增殖活性的細(xì)胞，是神經(jīng)干細(xì)胞研究中最常用的標(biāo)記物[8]。本實(shí)驗(yàn)采用BrdU標(biāo)記，很好地顯示海馬齒狀回增殖細(xì)胞，并通過(guò)熒光雙標(biāo)染色判斷增殖細(xì)胞的分化情況，觀(guān)察分化為神經(jīng)元還是膠質(zhì)細(xì)胞。

海馬神經(jīng)發(fā)生是經(jīng)過(guò)一系列具有不同調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜步驟產(chǎn)生的終產(chǎn)物，包括神經(jīng)干細(xì)胞的存活、增殖、分化、遷移以及結(jié)構(gòu)和功能的整合[9-10]。許多因素對(duì)成年期神經(jīng)干細(xì)胞活性具有調(diào)節(jié)作用，如Notch、BMPs、Eph/ephrins、Noggin、Wnt/β-catenin等在成體神經(jīng)發(fā)生的微環(huán)境中發(fā)揮重要的作用。其中Noggin與BMP4對(duì)NSC的增殖、分化具有重要意義。

大量的研究表明，Noggin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用與其形成的濃度梯度及拮抗劑BMP4的濃度梯度有關(guān)。局部的配體與拮抗劑的濃度決定了Noggin信號(hào)的梯度。Zimmerman等[11]研究證實(shí)Noggin拮抗BMP4作用呈劑量依賴(lài)性，16 nmol/L Noggin 蛋白能夠抑制0.1 pmol/L～6.66 nmol/L BMP4的活性；420 pmol/L BMP4與160 pmol/L Noggin(38% of 420 pmol/L)共同孵育，則BMP4的活性被抑制39%，而830 pmol/L BMP4與160 pmol/L Noggin(19% of 830 pmol/L) 共同孵育能夠抑制16%的活性。Noggin劑量與抑制BMP4作用的線(xiàn)性量效關(guān)系，亦表明兩種蛋白存在直接作用。Shou等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，BMPs對(duì)嗅球的神經(jīng)發(fā)生具有抑制與促進(jìn)兩種作用，低濃度的BMP4促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，高濃度的BMP4抑制神經(jīng)發(fā)生。BMPs的作用與Noggin特性、配體濃度有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Noggin mRNA表達(dá)與海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖具有密切相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組各時(shí)期Noggin mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化，且各時(shí)期NSC增殖也處于“靜息”狀態(tài)。模型組缺血1周、2周Noggin mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增高，而此時(shí)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖也最顯著，這說(shuō)明Noggin對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有調(diào)控作用，而缺血損傷可能會(huì)激發(fā)Noggin等調(diào)控因子表達(dá)增強(qiáng)來(lái)進(jìn)行自我修復(fù)，促進(jìn)干細(xì)胞的增殖、分化。內(nèi)源性NSC雖然可以對(duì)損傷信號(hào)產(chǎn)生應(yīng)答，通過(guò)增殖、分化、遷移修復(fù)部分功能，但損傷信號(hào)對(duì)成體神經(jīng)干細(xì)胞的影響是有限的，Arvidsson等[13]實(shí)驗(yàn)表明，缺血6周后新生神經(jīng)元僅占死亡神經(jīng)元的0.2%。因此，通過(guò)體外定向誘導(dǎo)(如學(xué)習(xí)鍛煉、針灸治療等)強(qiáng)化環(huán)境信號(hào)是促進(jìn)神經(jīng)再生的重要途徑。對(duì)BMP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，缺血后BMP4 mRNA一直持續(xù)高表達(dá)狀態(tài)，4周達(dá)到最高，而同時(shí)相電針組BMP4相對(duì)表達(dá)降低，結(jié)合兩組神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化新生細(xì)胞數(shù)量來(lái)看，BMP4可能與促進(jìn)NSC膠質(zhì)分化有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Noggin/BMP4比值來(lái)反映兩基因之間的拮抗效應(yīng)對(duì)神經(jīng)發(fā)生的影響。對(duì)相關(guān)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，該比值與Noggin相對(duì)表達(dá)情況趨向基本一致，能夠充分反映Noggin在促神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化中的正向調(diào)節(jié)作用。

通過(guò)分析電針對(duì)慢性腦灌注不足大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及海馬Noggin、BMP4 mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)電針可以通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠海馬Noggin與BMP4基因的表達(dá)促使海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、定向分化。進(jìn)而推斷：電針改善慢性腦灌注不足大鼠缺血性腦病可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Noggin/BMP4的表達(dá)，促使海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖、存活及定向分化等一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。