2017～2018年成都市三區(qū)縣外環(huán)境禽流感監(jiān)測分析

劉毅 范鵬程 曾學(xué)民

摘 要：目的 監(jiān)測四川省成都市三區(qū)縣外環(huán)境中禽類流行性感冒（禽流感）病毒的分布狀況，為人禽流感防控提供參考依據(jù)。方法 我中心在2017年5月～2018年5月采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測成都市三區(qū)縣外環(huán)境中甲型流感通用病毒，再將陽性標(biāo)本進(jìn)行H5、H7、N9和H9分型，采用χ2檢驗(yàn)比較定性資料。結(jié)果 在497份樣本中，甲型流感病毒陽性標(biāo)本87份，檢出率為17.91%；分型實(shí)驗(yàn)中，H5、H7、N9和H9分別檢出7份、6份、12份和41份，其陽性檢出率依次為1.41%、1.21%、2.41%、8.25%，未分型成功23份，占總樣本的4.63%。結(jié)論 成都市三區(qū)縣外環(huán)境存在禽流感病毒污染，有人感染禽流感風(fēng)險(xiǎn)；需加強(qiáng)對外環(huán)境及高危人群禽流感監(jiān)測，并規(guī)范對市場的管理機(jī)制，落實(shí)消毒和檢疫準(zhǔn)入等預(yù)防措施。

關(guān)鍵詞：禽流感；監(jiān)測；外環(huán)境

中圖分類號(hào)：R181.8；R511.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.17.036

文章編號(hào)：1006-1959（2018）17-0119-03

Abstract：Objective To monitor the distribution of avian influenza（avian influenza）virus in the external environment the three districts of Chengdu，Sichuan province，and provide reference for the prevention and control of human avian influenza.Methods From May 2017 to May 2018，our center used real-time fluorescent quantitative PCR to detect influenza A virus in the external environment of the three districts of Chengdu.The positive samples were classified into H5，H7，N9 and H9，qualitative data were compared using the χ2 test.Results Among the 497 samples，87 were positive for influenza A virus，and the detection rate was 17.91%.In the typing experiment，7，6，12 and 41 were detected for H5，H7，N9 and H9，respectively.The positive detection rate was 1.41%，1.21%，2.41%，and 8.25%，and 23 cases were untyped，accounting for 4.63% of the total sample.Conclusion There is avian influenza virus contamination in the external environment the three districts of Chengdu，and some people are infected with avian influenza.It is necessary to strengthen the monitoring of avian influenza in the external environment and high-risk population，and regulate the market management mechanism and implement preventive measures such as disinfection and quarantine access.

Key words：Avian influenza；Monitoring；External environment

禽類流行性感冒又稱禽流感（avian influenza），是由甲型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽類間的傳染病，一般不會(huì)感染人，但由于病毒在復(fù)制時(shí)其RNA不穩(wěn)定，易發(fā)生基因突變、重組，從而獲得感染人的能力，導(dǎo)致人禽流感疾病的發(fā)生，近年來在人群中造成嚴(yán)重的公共健康的威脅[1，2]。根據(jù)病毒致病性強(qiáng)弱，分為高致病性、低致病性和非致病性三類，目前引起人禽流感主要為H5N1、H7N1、H7N9和H9N2等[3]。2016年成都市連續(xù)確診1例人感染H5N1、1例重癥肺炎感染H9N2，通過流行病學(xué)調(diào)查2例患者均有活禽市場暴露史[4，5]。為了解成都市三區(qū)縣環(huán)境禽流感病毒的動(dòng)態(tài)分布情況及其差異，科學(xué)開展預(yù)警預(yù)測工作，成華區(qū)疾控中心按照成都市疾控中心的要求，自2017年5月起，開展成華區(qū)、大邑縣、崇州市三地的外環(huán)境禽流感監(jiān)測。

1對象與方法

1.1監(jiān)測點(diǎn) 根據(jù)《成都市H7N9禽流感環(huán)境監(jiān)測方案》的要求，以及三地禽類養(yǎng)殖、活禽交易市場分布特點(diǎn)，2017年5月為基線監(jiān)測，監(jiān)測點(diǎn)位為活禽市場。之后監(jiān)測點(diǎn)設(shè)置為活禽市場（尤其是活禽批發(fā)市場）、售賣禽類流動(dòng)攤販和自養(yǎng)禽家庭。

1.2監(jiān)測時(shí)間及采樣數(shù)量

1.2.1基線監(jiān)測期 每個(gè)活禽市場采集3～5份環(huán)境綜合涂抹樣，標(biāo)本應(yīng)盡量覆蓋多個(gè)攤位。

1.2.2流行期 為每年10月到次年4月。每個(gè)活禽市場采集1～3份環(huán)境綜合涂抹樣，采集售賣禽類流動(dòng)攤販3～5家（每家1個(gè)環(huán)境綜合涂抹樣），采集自養(yǎng)禽家庭3～5家（每家1個(gè)環(huán)境綜合涂抹樣）。

1.2.3非流行期 為每年5月～9月。每個(gè)活禽市場采集1份環(huán)境綜合涂抹樣，采集售賣禽類流動(dòng)攤販1～2家（每家1個(gè)環(huán)境綜合涂抹樣），采集自養(yǎng)禽家庭1～2家（每家1個(gè)環(huán)境綜合涂抹樣）。

1.3監(jiān)測采集樣品 按照流感疫情防控方案的要求，進(jìn)行標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸，采樣使用病毒采樣管，主要采集家禽糞便標(biāo)本，籠具表面涂抹物，禽類飲水，清洗禽類的污水，宰殺或擺放，禽肉案板表面的涂抹物及其他標(biāo)本，標(biāo)本在4 ℃條件下，24 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，未能按時(shí)送達(dá)，至于-70 ℃以下保存。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1儀器與試劑 熒光PCR檢測儀器型號(hào)為美國ABI Stepone plus Real-time PCR，核酸提取試劑來源于西安天隆科技有限公司，PCR檢測試劑來源于江蘇碩世生物科技有限公司，檢測技術(shù)依據(jù)為《職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測方案（2011年版）》。

1.4.2方法 采用病毒核酸提取試劑盒從環(huán)境標(biāo)本中提取病毒RNA后，通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，即熒光定量PCR，首先進(jìn)行甲型流感病毒（FluA）通用引物核酸檢測，若甲型陽性，則進(jìn)行H5、H7、H9和N9亞型鑒定。

熒光定量PCR反應(yīng)液體系：總體積20 μl，包括RT-PCR反應(yīng)液7.5 μl、酶混合液5 μl、反應(yīng)液4 μl、模板3.5 μl、去RNA酶水3.5 μl；參數(shù)設(shè)置：50 ℃，30 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃，10 s→55 ℃，40 s，45個(gè)循環(huán)，在55 ℃熒光通道檢測；探針檢測模式設(shè)置：Reporter1 Dye：FAM，Reporter2 Dye：VIC，QueNcHer Dye：NoNe，Passive RefereNce：NoNe。

1.4.3結(jié)果判定 ①陰性：檢測樣本Ct值為UNDET或40；②陽性：檢測樣本Ct值≤35；③如果檢測樣本Ct值為35～38，需重復(fù)檢測，Ct值仍在此區(qū)間且曲線呈標(biāo)準(zhǔn)S型且有明顯指數(shù)增長期，則判斷為陽性，否則判斷為陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用？字2檢驗(yàn)和Fisher確切檢驗(yàn)進(jìn)行樣本率間的比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1標(biāo)本檢測及分型情況 2017年5月～2018年5月共監(jiān)測497份外環(huán)境標(biāo)本，檢出FluA病毒核酸陽性標(biāo)本89份，陽性率17.91%，監(jiān)測到了H5、H7、H9、N9和其他未分型的禽流感病毒。其中H9陽性標(biāo)本41份，檢出率最高，為8.25%；N9、H5和H7的陽性標(biāo)本分別為12份、7份和6份，其檢出率分別是2.41%、1.41%和1.21%；未能分型的標(biāo)本為23份，占標(biāo)本的總量的4.63%。

2.2不同地區(qū)禽流感外環(huán)境陽性標(biāo)本分布情況 三個(gè)地區(qū)FluA陽性率最高是成華區(qū)，其次是崇州市，最低的是大邑縣。成華區(qū)的檢出率最高，在分型中并未檢出N9型；在崇州市的檢出中，H7型未檢出；而大邑縣未檢出H5、H7和H9。不同地區(qū)的FluA陽性檢出率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在不同地區(qū)分型實(shí)驗(yàn)中，H5、H7和H9比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而N9和未分型的陽性率在不同地區(qū)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.3不同季度禽流感外環(huán)境陽性標(biāo)本分布情況 不同季度的FluA陽性檢出率不同，其中第一季度的FluA陽性檢出率最高，然后依次是第四季度、第三季度和第二季度，不同季度的FluA陽性檢出率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=21.348，P<0.05）。第一季度中，主要檢出N9和H9型，未檢出H7和未分型；第二季度未檢出H5；在第四季度中，主要檢出H9和未分型，未檢出H7和N9型；第三季度與第四季度相同，未檢出H7和N9型，H9的檢出率最高，H5和未分型的檢出率相同；其中，只在第二季度檢出了H7型。不同季度的H5和H9陽性檢出率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=13.801和17.717，P<0.05），不同季度未分型的陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=5.944，P>0.05），見表2。

3討論

禽流感病毒主要是通過禽類的糞便以及呼吸道分泌物等方式大量排出，病毒在低溫如0～4 ℃的條件下可以存活1個(gè)月以上，在室溫條件下可以存活1周[6]。目前在禽流感病毒亞型中，有人感染病例報(bào)告的為H5、H6、H7、H9以及H10，其中H5和H7為高致病性的亞型[7]。

在對成都市三地區(qū)外環(huán)境禽流感病毒的監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，三個(gè)地區(qū)的FluA病毒的陽性率低于成都地區(qū)整體的陽性率。在分型中，H9病毒亞型為三個(gè)地區(qū)最為流行，這與戴映雪等[8]所報(bào)道的在成都地區(qū)H5、H9為主要分型符合，但在這三個(gè)地區(qū)，H5型的污染較成都市整體低，H5和H9均具有較大潛在的危害，其中H9在禽間的流行范圍最廣。三個(gè)地區(qū)對比之后發(fā)現(xiàn)，成華區(qū)FluA病毒的陽性檢出率最高，且H5、H7亞型陽性檢出率較其他兩個(gè)地區(qū)高，而N9亞型僅在崇州市檢出，這說明在不同地區(qū)環(huán)境監(jiān)測標(biāo)本禽流感病毒核酸流行不同亞型，其致病潛在風(fēng)險(xiǎn)程度不同。在不同時(shí)間可以看出，第一季度和第四季度外環(huán)境的FluA病毒陽性檢出率較高，其中高致病性H5亞型在第一季度陽性率最高，這與中國疾病預(yù)防控制中心在分析人禽流感病例所得結(jié)論一致，人感染禽流感的高峰期在冬春季節(jié)發(fā)生[9]。所以根據(jù)不同季節(jié)的流行情況，加大監(jiān)督力度，加強(qiáng)監(jiān)督頻率，對潛在的感染因素做到有效的預(yù)防。

為有效預(yù)防人感染禽流感病毒，應(yīng)從傳染源、傳播途徑及高危易感人群方面采取積極防控措施。首先持續(xù)加強(qiáng)對禽流感外環(huán)境的實(shí)時(shí)監(jiān)測，掌握病毒的流行趨勢及特征，為制定有效防控措施提供準(zhǔn)確的方向及科學(xué)依據(jù)；其次，在城區(qū)范圍內(nèi)，禁止活禽宰殺市場，并改變農(nóng)村地區(qū)家禽散養(yǎng)的模式，有效控制傳染源；加強(qiáng)對禽類從業(yè)人員的健康的宣傳教育，提高其防護(hù)意識(shí)，注意衛(wèi)生并堅(jiān)持定期消毒等，降低高危易感人群感染風(fēng)險(xiǎn)。

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收稿日期：2018-8-21；修回日期：2018-8-30

編輯/楊倩