池蝶蚌HsCTL的分子特征及表達(dá)分析

彭扣， 陳永玲， 王軍花， 邱齊駿， 洪一江

(1. 南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南昌 330031； 2. 江西省水產(chǎn)動物資源與利用重點實驗室， 南昌 330031； 3. 江西省撫州市水產(chǎn)科學(xué)研究所，撫州 344000)

凝集素(Lectin)是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類能夠識別糖類或糖復(fù)合物的糖蛋白，廣泛存在于動植物等生物體中[1]。在機體抵抗病原體的免疫防御中，凝集素具有識別、黏附、調(diào)理和促吞噬等生理功能，尤其是在無脊椎動物先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2]。凝集素依據(jù)其CRD的特征和排列方式還可分為P型、M型、F型、R型和C型等多種類型[1]，其中C-型(CTL)被認(rèn)為在機體免疫系統(tǒng)中起極其關(guān)鍵作用，也是目前研究最多的一類[1,3]。有文獻(xiàn)報道， CTL的主要特征包括一個或多個CRD結(jié)構(gòu)域、具鈣離子(Ca2+)結(jié)合位點、存在4～6個較為保守的半胱氨酸殘基等，其活性發(fā)揮需要Ca2+的參與[1-2,4]。在無脊椎動物中，由于不具有高等動物中的獲得性免疫系統(tǒng)，其對病原微生物的防御主要依賴于天然免疫的有關(guān)機制，即通過自身一些模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)來辨別或識別病原微生物表面上的一些病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)[5]。貝類PRR的種類多樣，有肽聚糖識別蛋白、革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白、Toll 樣受體和CTLs等[5]。其中，CTLs表現(xiàn)出能夠?qū)Ｒ恍缘刈R別病原微生物細(xì)胞壁上的多糖組分(一種PAMP)。且不同微生物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)存在多糖組分上的組成差異，如革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁表現(xiàn)為肽聚糖含量較豐富，陰性菌細(xì)胞壁則脂多糖(LPS)含量較豐富，甚至不同種真菌細(xì)胞壁也存在如β-1,3-葡聚糖、半乳聚糖和甘露聚糖等組分差異[5]。因此，研究貝類CTLs的分子特征有助于了解其參與的潛在抗菌種類情況。此外，在貝類抗菌侵染中，當(dāng)PRR(如CTL)識別PAMP(如病原菌細(xì)胞壁上某一多糖組分)后，會激活存在于貝自身體液中的蛋白酶或胞內(nèi)信號從而引起細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)[3,5]，由此，對其CTL的克隆及分子結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析還可為研究該CTL參與的免疫相關(guān)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑奠定基礎(chǔ)。近年來，已在太平洋牡蠣(Crassostreagigas)[6-7]、海灣扇貝(Argopectenirradians)[8-10]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[11-12]、文蛤(Meretrixmeretrix)[13]、合浦珠母貝(Pinctadafucata)[14-15]等多種軟體動物中克隆到CTLs家族基因，然而對淡水養(yǎng)殖貝類的凝集素研究較少，且未見有淡水育珠貝池蝶蚌(Hyriopsisschlegelii)CTL(HsCTL)的分子特征及其有關(guān)功能的報道。

池蝶蚌與我國當(dāng)前廣泛應(yīng)用于淡水育珠的三角帆蚌同為帆蚌屬(Hyriopsis)，其原產(chǎn)于日本滋賀縣琵琶湖，1997年從日本引進(jìn)后，本課題組對其開展了育珠、抗病和遺傳育種等相關(guān)研究[16-21]。池蝶蚌因其育珠性能佳、抗病及環(huán)境適應(yīng)能力強等特點現(xiàn)養(yǎng)殖面積得到迅速擴大，已成為我國淡水育珠又一重要經(jīng)濟(jì)貝類[20]。通過研究HsCTL在脂多糖刺激后的表達(dá)特征，期望能發(fā)現(xiàn)HsCTL在池蝶蚌防御病原感染中的作用，為淡水貝的防御機制研究做出有益補充，并對其病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

池蝶蚌采自撫州池蝶蚌良種養(yǎng)殖基地，3齡，體質(zhì)健壯，噴水有力，外套膜厚實，外鰓完好無傷。蚌取回實驗室置水族箱暫養(yǎng)一周?？照{(diào)房保持水溫22℃～25℃，增氧泵連續(xù)充氣，且每2天換水1/3。實驗取材時，隨機選取3只蚌，解剖取其外套膜、鰓、肝胰腺、閉殼肌、血細(xì)胞和性腺，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 EST序列獲得

池蝶蚌性腺組織轉(zhuǎn)錄組高通量測序由本課題組提供原材料并送交深圳華大基因完成，共獲得132 055個Unigenes[21]，分析發(fā)現(xiàn)，其中包括一條在NCBI比對后發(fā)現(xiàn)與其他物種CTL同源的EST序列。

1.3 RNA的提取和cDNA模板的合成

池蝶蚌組織在液氮研磨后利用Trizol試劑(Invitrogen, USA)一步法提取總RNA，應(yīng)用商業(yè)購買的Clontech公司SMARTTM-RACE cDNA Amplification Kit試劑盒分別合成5′-RACE-Ready和3′-RACE-Ready cDNA。另外，對于合成用于組織表達(dá)熒光定量RT-PCR分析的cDNA，則是先將提取的總RNA用DNaseⅠ(TaKaRa, Japan)處理后，并按試劑盒推薦方法，以O(shè)ligo (dT)18作為反轉(zhuǎn)錄引物，用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (Promega, USA) 將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4全長cDNA克隆和序列分析

用于3′ RACE 和 5′ RACE 擴增的特異性引物3GSP1、3GSP2、5GSP1和5GSP2是根據(jù)如上池蝶蚌轉(zhuǎn)錄組高通量測序獲得的HsCTL的EST序列設(shè)計，進(jìn)而參考RACE 試劑盒中操作說明，并在本研究中做適度修改分別進(jìn)行3′和5′ RACE 擴增。3′ RACE擴增即是先用引物HsCTL-3GSP1和通用引物UPM配對(表1)，以反轉(zhuǎn)錄的3′ RACE-cDNA為模板，進(jìn)行 3′ 端第一輪PCR擴增；而后，以稀釋15倍的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，再用引物HsCTL-3GSP2和NUP，進(jìn)行第二輪PCR擴增，最終獲得特異性擴增條帶；同理，5′ RACE則是引物HsCTL-5GSP1和HsCTL-5GSP2 分別同通用引物UPM和NUP進(jìn)行配對，同上類似分別進(jìn)行第一輪和第二輪PCR的5′ 端RACE擴增。第一輪PCR為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。第二輪PCR為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，25個循環(huán)；72℃再延伸10 min。1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有特異性擴增目的條帶，若有，則使用OMEGA切膠回收試劑盒回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接pMD19-T載體上，再轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH 5α，用氨芐青霉素并結(jié)合菌落PCR篩選陽性菌落，挑選陽性菌落送上海生工進(jìn)行測序。

用DNAStar 軟件進(jìn)行5′ RACE、EST和3′ RACE序列拼接以及其開放閱讀框(ORF) 的預(yù)測和氨基酸翻譯。將所得序列在NCBI 網(wǎng)站(http://www.ncbi. nlm.nih.gov) 上進(jìn)行BLAST比對分析，再應(yīng)用引物HsCTL-ORF-F和HsCTL-ORF-R配對對預(yù)測的ORF進(jìn)行擴增和測序確認(rèn)。同時在GenBank中下載與HsCTL序列相似的其他物種的CTLs，選取各物種CTLs中的CRD區(qū)，采用Clustal W 軟件進(jìn)行多序列比對分析。使用Signal P 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 進(jìn)行信號肽預(yù)測，應(yīng)用SMART工具(http://smart.embl-heide lberg.de/)進(jìn)行三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測和對比分析。利用Mega 4.1軟件，基于鄰位相接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap 設(shè)置重復(fù)1000次計算各分支置信度。

1.5 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)qRT-PCR分析

根據(jù)1.4中的方法獲得的HsCTL基因cDNA全長序列應(yīng)用Primer 3設(shè)計上下游引物(HsCTL-qPCR-F/R)，見表1。內(nèi)參基因β-actin上下游引物β-actin-qPCR-F/R根據(jù)GenBank中池蝶蚌β-actin(GenBank登錄號：EU047596)部分序列設(shè)計。取50只蚌隨機分成兩組分養(yǎng)在兩個水族箱中，實驗組蚌往其閉殼肌內(nèi)注射無菌PBS(Phosphate buffer saline)溶解的LPS 100 μL(10 μg/μL)，對照組則注射相同劑量的PBS，0 h組為針刺刺激，而后隔6 、12 、24 、48 和72 h，分別取實驗組和對照組的血細(xì)胞和肝胰腺組織，按如上1.1和1.3所述方法獲得用于基因組織表達(dá)定量分析的cDNA。用于定量分析的試劑盒為TaKaRa公司的SYBR?Green I檢測試劑盒，反應(yīng)體系和PCR擴增程序均參考 SYBR?Premix ExTaqTMⅡ說明書執(zhí)行，數(shù)據(jù)處理采用 2-ΔΔCT方法[16-20]。使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 實驗所用引物名稱及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 HsCTL全長cDNA克隆及序列分析

HsCTLcDNA全長1716 bp，包括92 bp的5′ 端非翻譯區(qū)(5′ UTR)，898 bp的3′ 端非翻譯區(qū)(3′ UTR)和726 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個由241個氨基酸殘基組成的蛋白，預(yù)測其分子量為28 ku，其中其3′ UTR具2個AATAAA加尾信號(圖 1)。該序列提交NCBI GenBank，登錄號為MF149970。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，其N端含有一個由23個氨基酸組成的信號肽，C端含有1個CRD結(jié)構(gòu)域，且CRD結(jié)構(gòu)域中有6個半胱氨酸(cys)殘基，分別位于第132、142、171、214、230和238位，并發(fā)現(xiàn)其CRD區(qū)存在一個QPD (Gln204-Pro205-Asp206)基序。此外，在線工具SMART預(yù)測結(jié)構(gòu)和對比分析結(jié)果如圖2顯示，HsCTL的CRD也同合浦珠母貝(PoCTL1和PoCTL2)及櫛孔扇貝(CTL)的CRD的空間結(jié)構(gòu)較為相似，均由2個α螺旋和中間反向平行的β折疊片層形成一個緊湊的球形結(jié)構(gòu)，預(yù)測還顯示HsCTL同PoCTL2各具1個Ca2+結(jié)合位點。

左邊數(shù)字表示核苷酸序列對應(yīng)編號，右邊數(shù)字表示氨基酸序列對應(yīng)編號；起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)均用藍(lán)色標(biāo)示，方框中為信號肽，灰色陰影部分為HsCTL的CRD結(jié)構(gòu)域，紅色標(biāo)注為HsCTL的6個保守半胱氨酸殘基，黃色為QPD (Gln-Pro-Asp) 基序，下劃線標(biāo)注為加尾信號AATAAA

圖1池蝶蚌HsCTL基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列

Fig 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences ofHsCTLcDNA

2.2 HsCTL與其他物種CTL多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

池蝶蚌HsCTL在NCBI完成蛋白序列BLAST比對結(jié)果顯示，HsCTL與斑節(jié)對蝦(P.monodon) CTL的同源性最高，為36%。同三角帆蚌(H.cumingii) perlucin[27]和海灣扇貝(Argopectenirradians)、長牡蠣(Crassostreagigas)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)、貽貝(Mytilusedulis)的CTL及合浦珠母貝 PoCTL1和PoCTL2的同源性分別為18.1%、14.2%、12.7%、12.2%、11.1%、10.5%和9.7%。進(jìn)一步對它們的CRD區(qū)進(jìn)行Clustal W比對分析結(jié)果(圖 3)表明，HsCTL含有該家族CRD所具有的一些保守氨基酸殘基和功能相關(guān)的結(jié)合位點，如其存在有參與二硫鍵形成的保守半胱氨酸且4個非常保守的Cys位點分別位于第142、214、230和238位，是典型的CTL。另外，在其CRD中存在一個糖結(jié)合特異性相關(guān)的“QPD”(Gln204-Pro205-Asp206)基序。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，HsCTL與斑節(jié)對蝦和中國明對蝦的CTL緊密聚為一支，之后依次與三角帆蚌perlucin和九孔鮑CTL聚為相鄰支，脊椎動物如石斑魚、小鼠、原雞和人的CTLs則聚為另一分離支(圖 4)。

4種CTL序列登錄號為：a 池蝶蚌HsCTL、b 合浦珠母貝PoCTL1(ACO36045)、c 合浦珠母貝PoCTL2(ADX95743)、d 櫛孔扇貝CTL(ABB71676)

圖2池蝶蚌HsCTL與合浦珠母貝PoCTL1、PoCTL2及
櫛孔扇貝CTL基因中CRD的三級結(jié)構(gòu)
Fig 2 The predicted tertiary structure of CRD inHsCTL,
PoCTL1, 2 and Scallop CTL

QPD (Gln-Pro-Asp) 基序用上劃線標(biāo)出，保守的半胱氨酸位點用*標(biāo)出；各物種CTL序列登錄號為：2 櫛孔扇貝(ABB71676)，3 合浦珠母貝PoCTL1(ACO36045)，4 PoCTL2(ADX95743)，5 三角帆蚌(AGI61062.1)，6 海灣扇貝(ACE80702.1)，7 貽貝(ADI71474.1)，8 太平洋牡蠣(BAF75353)

圖3池蝶蚌HsCTL的CRD與其他物種CTL的
CRD區(qū)氨基酸序列比對
Fig 3 Amino acid sequences alignment ofH.schlegelii
HsCTL with other species′ lectin

2.3 HsCTL mRNA的組織分布

利用real-time RT-PCR分析了池蝶蚌HsCTL基因在3齡健康成體不同組織中的表達(dá)水平。結(jié)果(如圖5)顯示：HsCTLmRNA在血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、外套膜、閉殼肌、性腺中均有表達(dá)。其中，在血細(xì)胞表達(dá)量最高，其次為外套膜和肝胰腺，在鰓、閉殼肌及性腺中的表達(dá)水平相對較低。

分叉處表示1000次重復(fù)抽樣計算所得的置信度，標(biāo)尺長度表示每個位點發(fā)生0.2次置換；各物種C-型凝聚素序列登錄號為：斑節(jié)對蝦(AAZ29608.1)，中國明對蝦(AAX63905.1)，三角帆蚌 (AGI61062.1)，九孔鮑(AEQ16379)，文昌魚(ABY54815)，合浦珠母貝(1)PoCTL1(ACO36045)，文蛤(ANS83633.1)，貽貝(ADI71474.1)，合浦珠母貝(2)PoCTL2(ADX95743.1)，脊尾白蝦(AIS36112.1)，長牡蠣(BAF75353)，櫛孔扇貝(ABB71676)，海灣扇貝(ACE80702.1)，赤點石斑魚(ACJ12598)，小鼠(NP_034949)，原雞(NP_001026644)，人(AAG00514)

圖4基于MEGA 4.1軟件構(gòu)建的HsCTL和
其他物種CTL的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig 4 NJ phylogenetic tree based on C-lectin
amino acid sequences by MEGA 4.1

β-actin為內(nèi)參基因，3次分離實驗檢測取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；*為差異顯著(P<0.05)；**為差異極顯著(P<0.01)

圖5池蝶蚌HsCTL基因在不同組織中的表達(dá)分布

Fig 5 Expression ofHsCTLmRNA in different tissues ofH.schlegelii

2.4 LPS免疫刺激后HsCTL在池蝶蚌血細(xì)胞和肝胰腺中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

Real-time RT-PCR進(jìn)一步檢測了池蝶蚌在注射LPS后其血細(xì)胞和肝胰腺中HsCTLmRNA的表達(dá)變化。結(jié)果表明：HsCTL基因的表達(dá)在注射PBS的對照組血細(xì)胞和肝胰腺中基本上沒有變化，而在注射LPS實驗組的血細(xì)胞中，6 h和12 h檢測顯示其表達(dá)量均下降，24 h表達(dá)量則明顯增加，48 h表達(dá)量又減少，72 h則輕微上調(diào)(圖6-A)。注射LPS實驗組的肝胰腺中，HsCTL的表達(dá)變化也基本相似，表現(xiàn)為一個波動變化，6 h為下調(diào)，12 h則顯著上調(diào)，24 h和48 h表現(xiàn)逐漸下調(diào)，72 h輕微上調(diào)(圖6-B)。

*為對應(yīng)時間點與其他任意時間點相比較差異顯著(P< 0.05)；**為對應(yīng)時間點與其他任意時間點相比較差異極顯著(P< 0.01)

圖6池蝶蚌HsCTL在LPS刺激下血細(xì)胞(A)
和肝胰腺(B)中的表達(dá)特征

Fig 6 Expression level ofHsCTLmRNA in hemocytes(A) and
hepatopancreas(B) after lipopolysacchride (LPS) stimulation

3 討論

CTL主要結(jié)構(gòu)特征是其分子含有一個或多個CRD結(jié)構(gòu)域[1]，CRD也稱糖識別結(jié)構(gòu)域。低等生物的CTL一般只含有一個CRD[14]，且其CRD的存在一定程度上具有替代獲得性免疫系統(tǒng)中免疫球蛋白的功能[1]。但在羅氏沼蝦和秀麗白蝦中已報道的CTL中均包含兩個CRD[23]，中國明對蝦和凡納濱對蝦的CTLs既有存在1個又有存在2個CRD的現(xiàn)象[23-24]。本研究克隆獲得的池蝶蚌HsCTLcDNA序列長度1716 bp，共編碼241個氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列中僅含一個CRD，這與已報道的太平洋牡蠣、合浦珠母貝、海灣扇貝、櫛孔扇貝和文蛤等貝類中的CTL均相似[6-15]，它們也都僅只含1個CRD，說明單個CRD可能普遍存在于貝類的CTLs中。池蝶蚌、櫛孔扇貝和合浦珠母貝(PoCTL1/2)CTLs中的CRD結(jié)構(gòu)域分別經(jīng)SMART預(yù)測后對比表明，HsCTL的CRD同后三者CTLs中的CRD的三維結(jié)構(gòu)基本相同，整個空間結(jié)構(gòu)緊湊成一個球形，這也與謝建輝等[1]關(guān)于CRD的結(jié)構(gòu)模型描述相吻合，即CRD區(qū)一般為110～130個氨基酸，通常由2個α螺旋及反平行的β折疊片形成球狀結(jié)構(gòu)。HsCTL的CRD同其他貝類CTLs的CRD類似，也均發(fā)現(xiàn)有6個較為保守的半胱氨酸殘基[6-15,22,27]，由半胱氨酸形成的二硫鍵可能對維持CRD的空間結(jié)構(gòu)有重要作用[14]。在脊椎動物中，CTL根據(jù)其CRD的一級結(jié)構(gòu)差異還可分為選擇素、膠原凝集素和巨噬細(xì)胞甘露糖受體等[25]。而在無脊椎動物中，也有包括CEL-Ⅰ/CEL-Ⅱ(N-乙酰半乳糖胺結(jié)合型)、CEL-Ⅲ(半乳糖結(jié)合型)和MBL-C(甘露糖結(jié)合型)等多種CTLs之分[26]。CTL的選擇性識別或結(jié)合功能主要體現(xiàn)在其CRD中的糖結(jié)合基序差異，也即不同的糖結(jié)合基序有選擇不同的多糖結(jié)合特性，糖結(jié)合基序一般又有EPN、EPD、QPD和QPN等[14-15,23]，其中EPN和EPD被認(rèn)為具甘露糖識別特性，而QPD和QPN被認(rèn)為有半乳糖識別特性[14,23]。在本研究中發(fā)現(xiàn)HsCTL的CRD中具有一個QPD基序，推測HsCTL具有識別感染微生物細(xì)胞表面的半乳糖有關(guān)的多糖結(jié)構(gòu)特性。此外，經(jīng)典的CTL識別糖配體一般要求有Ca2+的參與，其CRD結(jié)構(gòu)域也通常含有Ca2+結(jié)合基序[1]。然而，也有文獻(xiàn)報道一些物種CTL其活性發(fā)揮也可不依賴Ca2+存在，如在草魚[25]和海綿[26]中鑒定的CTL其功能發(fā)揮可不依賴Ca2+。HsCTL預(yù)測發(fā)現(xiàn)具Ca2+結(jié)合位點，暗示其功能活性可能依賴于Ca2+的存在，這也同文獻(xiàn)報道QPD、KPS和LDN等基序為Ca2+依賴性特征相吻合[25]，然而HsCTL活性是否真實需Ca2+參與仍需進(jìn)一步實驗驗證。此外，HsCTL包含一個信號肽序列(M1-A23)，表明其為分泌型蛋白，同已報道的其他物種CTL的分子特征相一致[6-15,22-24]。

多序列比對表明，除HsCTL與斑節(jié)對蝦的CTL有36%的同源性外，同其他已報道的貝類的CTL同源性僅為9.7%～18.1%，同源性程度總體上偏低，包括同三角帆蚌中克隆到的perlucin[22]相比較，相似度也僅為18.1%。池蝶蚌與三角帆蚌親緣關(guān)系非常近，為同屬不同種[16,19-20]。采用同源克隆的方法我們在池蝶蚌中也獲得了一條與三角帆蚌perlucin相似度為82.6%的perlucin-like序列，這說明在本研究中鑒定到的HsCTL可能為其CTL超家族中的一個新成員。進(jìn)一步將HsCTL的CRD同已報道的其他貝類CTL的CRD進(jìn)行序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)它們CRD之間的相似度仍是不高，這與李斌等[3]報道一致，CTL在脊椎動物中較保守，而在無脊椎動物中則表現(xiàn)出一定的多樣性。例如，文蛤Mm-Lec1與其他物種的CTL的相似度也僅在20%～32%之間[27]，貽貝的CTL與其他物種CTLs的相似性為45%～50%，櫛孔扇貝5個CTLs的相似性也只為31%～46%[14]，可見CTL是一個具有保守序列并且進(jìn)化較快的基因[27]，這可能是與無脊椎動物免疫相關(guān)基因如CTL具有較高變異性特點相關(guān)[28]。此外，NJ系統(tǒng)樹的結(jié)果分析也顯示出不同物種及同一物種的CTLs沒有產(chǎn)生特別明顯的系統(tǒng)分化關(guān)系，例如，HsCTL并沒有先同其他雙殼類貝的CTLs緊密聚為一支，而與甲殼類的斑節(jié)對蝦和中國明對蝦的CTLs聚為一支，另一種可能是在傳統(tǒng)分類學(xué)與池蝶蚌親緣關(guān)系較近的其他貝類中目前暫未克隆到與HsCTL系統(tǒng)進(jìn)化更近的同源子。

HsCTLmRNA的組織表達(dá)結(jié)果顯示其在各組織中均有表達(dá)，且血細(xì)胞中最高，肝胰腺和外套膜次之。貝類血細(xì)胞不僅可識別和參與吞噬病原菌的作用，還可合成和分泌一些調(diào)理吞噬和中和病毒等具免疫功能活性的物質(zhì)[16]，池蝶蚌血細(xì)胞中高表達(dá)的HsCTL推測其可能參與識別表面組分具半乳糖基配體的病原菌，由此來調(diào)理和增強血細(xì)胞吞噬的功能。肝胰腺也與貝類的免疫有密切關(guān)系，肝胰腺主要參與消化、吸收和代謝等多種生理活動，且絕大多數(shù)免疫相關(guān)基因在肝胰腺中均有較高表達(dá)[16-20]，組織表達(dá)檢測結(jié)果表明HsCTL是其中之一。文獻(xiàn)報道，CTL在其他物種各組織中的表達(dá)水平存在差異，如合浦珠母貝和櫛孔扇貝的CTL均是在肝胰腺的表達(dá)量最高[11,14]，文蛤Mm-Lec1的最高表達(dá)量則出現(xiàn)在鰓中[27]，秀麗白蝦中4種CTLs也呈現(xiàn)出不同的組織表達(dá)譜[23]。本研究鑒定的HsCTL與其他貝類CTL的組織表達(dá)譜并不完全相同，推測其可能是池蝶蚌CTL超家族中新的一員。此外，HsCTL在池蝶蚌外套膜上呈現(xiàn)次高的表達(dá)水平，暗示其可能還輔助參與貝殼或珍珠分泌的作用，正如三角帆蚌perlucin基因在其外套膜上被原位雜交檢測到，作者推測其具類似功能[22]。

貝類免疫系統(tǒng)比較簡單，易受外界各種因子脅迫影響。在抵抗病原菌感染的先天免疫防御中，CTL被認(rèn)為扮演著重要的作用。為證實HsCTL是否參與了池蝶蚌抗病原菌感染的免疫作用，本試驗中采用注射脂多糖的方法來模擬病原體的入侵。經(jīng)脂多糖刺激后，發(fā)現(xiàn)池蝶蚌血細(xì)胞和肝胰腺中的HsCTLmRNA表達(dá)量均顯著地上升，這也與病原菌刺激文蛤[13,27]、櫛孔扇貝[11]、合浦珠母貝[14-15]及甲殼類如凡納濱對蝦[24]和脊尾白蝦[2]等后其免疫相關(guān)組織中的CTL基因的表達(dá)變化相類似，說明HsCTL參與了池蝶蚌的免疫防御作用，結(jié)果為研究基于HsCTL激活下的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子免疫機制打下基礎(chǔ)，同時也可為貝類病害的防控奠定基礎(chǔ)。