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    猴源輪狀病毒SA11 株Balb/c乳鼠動(dòng)物模型的建立

    2018-12-12 09:39:06喬洪圖陳林林孫茂盛李鴻鈞
    生物學(xué)雜志 2018年6期
    關(guān)鍵詞:乳鼠膠體金輪狀病毒

    喬洪圖, 周 艷, 尹 娜, 陳林林, 劉 洋, 蘇 婷, 孫茂盛, 李鴻鈞

    (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所, 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650118)

    輪狀病毒(Rotavirus,RV)是導(dǎo)致5歲以下嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的重要病原體之一[1]。每年全世界大約有2億嬰幼兒感染輪狀病毒并發(fā)生腹瀉,大約50萬(wàn)兒童死于該疾病[2-3]。輪狀病毒動(dòng)物模型的建立有利于研究RV的感染機(jī)制及研發(fā)預(yù)防和治療RV感染的疫苗和特效藥物。國(guó)內(nèi)外曾報(bào)道與輪狀病毒相關(guān)的動(dòng)物模型,包括無(wú)菌小豬、鼠、牛、羊、兔等,其中無(wú)菌小豬和乳鼠的研究較為成熟[4-5]。無(wú)菌小豬免疫系統(tǒng)與人類較為接近,且致病周期長(zhǎng),但是對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高,操作起來(lái)較為困難[6]。而乳鼠對(duì)輪狀病毒易感且繁殖能力強(qiáng),易于試驗(yàn)操作,因此我們選擇了Balb/c乳鼠來(lái)進(jìn)行輪狀病毒的建模。

    本研究采用猴源輪狀病毒SA11,分別用不同劑量的毒株經(jīng)單次灌胃感染7 d齡的Balb/c乳鼠,建立猴源輪狀病毒SA11的Balb/c乳鼠動(dòng)物模型,為后續(xù)疫苗的研發(fā)及疫苗保護(hù)性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    MA104細(xì)胞、SA11毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存;輪狀病毒膠體金試劑盒(北京萬(wàn)泰生物);組織細(xì)胞原位凋亡檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自Vazyme公司);FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG(H+L)抗體(購(gòu)自KPL公司);SPF級(jí)Balb/c乳鼠(購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

    1.2 方法

    1.2.1 病毒培養(yǎng)

    SA11株RV的增殖和滴度測(cè)定在MA104上進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層時(shí)接種RV。接種前,將原始病毒液從-80℃冰箱中取出,室溫溶解,向待接種的輪狀病毒液中加入終濃度為20 μg/mL的胰酶和600 μg/mL的氯化鈣,37℃水浴45 min。水浴完畢,將長(zhǎng)成致密單層的MA104細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的含10%新生牛血清MEM生長(zhǎng)液棄掉,加入無(wú)血清MEM維持液,反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶清洗細(xì)胞,如此操作重復(fù)3遍,將清洗細(xì)胞的MEM維持液棄掉,加入已經(jīng)激活的輪狀病毒液,置于37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附90 min。向MEM維持液中加入終濃度為1 μg/mL的胰蛋白酶,并將其轉(zhuǎn)入吸附病毒的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)期間,觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),當(dāng)90%以上的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí),即可收獲病毒。將收獲的病毒培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次,使細(xì)胞破碎,釋放病毒,8000 r/min,4℃離心20 min,去除大的細(xì)胞碎片等成分,收集上清液,即病毒原液保存于-80℃冰箱備用。

    1.2.2 乳鼠灌胃攻毒

    灌胃攻毒之前,采集乳鼠糞便,離心取上清,輪狀病毒膠體金試劑盒及ELISA檢測(cè)糞便上清中是否存在RV抗原,尾靜脈采取Balb/c母鼠全血,ELISA檢測(cè)母鼠血清中是否存在抗輪狀病毒特異性抗體,排除所有輪狀病毒抗體陽(yáng)性的動(dòng)物。由于乳鼠過(guò)小,人工飼養(yǎng)困難,同一組乳鼠與哺乳母鼠同籠喂養(yǎng)。攻毒之前將7 d齡乳鼠與哺乳母鼠隔離,對(duì)乳鼠進(jìn)行饑餓1 h處理。分組情況如下:106PFU SA11/只、105PFU SA11/只、104PFU SA11/只、PBS,每組10只,利用8號(hào)灌胃針對(duì)乳鼠進(jìn)行單次灌胃感染。

    1.2.3 攻毒后乳鼠腹瀉及精神狀態(tài)觀察

    攻毒后0到7 d,將乳鼠與母鼠同籠喂養(yǎng),每天觀察攻毒后乳鼠的精神狀態(tài)、腹瀉情況等。每隔24 h通過(guò)按壓乳鼠腹部采集乳鼠糞便,依據(jù)Boshuizen等對(duì)乳鼠腹瀉的評(píng)分規(guī)則,根據(jù)糞便的顏色、軟硬、數(shù)量等,對(duì)乳鼠的腹瀉進(jìn)行評(píng)分(0~4),無(wú)糞便排出評(píng)分0分、棕色成形大便評(píng)分1 分、 棕色軟大便評(píng)分2 分、黃色軟大便評(píng)分3 分、黃色稀水樣便評(píng)分4 分、肛周糞便污染評(píng)分4 分,大于2分被認(rèn)為是有腹瀉[7]。并進(jìn)一步將糞便重懸于10%(M/V)冰冷的PBS中,8000 r/min離心取上清,分別使用輪狀病毒膠體金試劑盒及ELISA檢測(cè)糞便中的病毒抗原載量。將糞便上清在已加入PBS稀釋液的已包被山羊抗輪狀病毒多克隆抗體的ELISA板中進(jìn)行梯度稀釋,將待測(cè)糞便上清以每孔100 μL的量加入到ELISA板的第一列(每孔含有100 μL的PBS稀釋液),形成1∶2的首稀釋度,然后將ELISA板第一列中2倍稀釋的糞便上清吸出100 μL加入到第二列孔中,形成1∶4的稀釋度,如此以2倍的稀釋度重復(fù)梯度稀釋10次,形成1∶2到1∶2048的稀釋度范圍,則待測(cè)糞便上清(100 μL)中的抗原量即等于其陽(yáng)性孔的最高稀釋度,其數(shù)值再乘以10即可得出待測(cè)輪狀病毒抗原每毫升的抗原量(EU/mL)。

    1.2.4 攻毒后乳鼠空腸的病理改變

    乳鼠感染輪狀病毒24、48、72和96 h后每個(gè)試驗(yàn)組各解剖乳鼠2只,取其空腸,將其固定于10%的福爾馬林溶液中,制作石蠟切片,經(jīng)HE染色觀察空腸的形態(tài)學(xué)改變。另取一份空腸固定于戊二醛中,用于電鏡觀察。

    1.2.5 攻毒后乳鼠臟器的輪狀病毒抗原分布情況

    乳鼠感染輪狀病毒24、48、72和96 h后每個(gè)試驗(yàn)組各解剖乳鼠2只,取其心、肝、脾、肺、腎、小腸(空腸)、腦組織,存放于液氮中,用于制作冰凍切片,免疫熒光檢測(cè)各組織中輪狀病毒抗原的分布。冰凍切片用丙酮于4℃固定30 min,風(fēng)干后用3% BSA(PBS-BSA)于37℃放置1 h;然后將山羊抗輪狀病毒多克隆抗體(Goat anti-Rotavirus polyclonal antibody)按1∶1000稀釋,37℃孵育90 min;0.05%Tween(PBS-T)洗3次;將FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG(H+L)抗體(Fluoresein Labeled Rabbit anti-Goat IgG(H+L)antibody)按1∶200稀釋,37℃孵育60 min;0.05%Tween(PBS-T)洗3次,顯微鏡觀察熒光。

    1.2.6 攻毒后乳鼠空腸原位凋亡檢測(cè)

    用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(1684817,Roche),對(duì)感染RV 72 h后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠空腸石蠟切片作原位細(xì)胞凋亡檢測(cè),操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。輪狀病毒感染小腸絨毛細(xì)胞后,會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生凋亡,細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂。本試劑盒采用TUNEL法,應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶在凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3′-羥基(3′-OH)末端催化摻入熒光素-12-脫氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP),F(xiàn)ITC-12-dUTP標(biāo)記的DNA可以用熒光顯微鏡直接觀察。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 乳鼠感染輪狀病毒后的臨床癥狀及排毒情況

    乳鼠攻毒不同劑量的RV 24 h后,高、中劑量組乳鼠均出現(xiàn)明顯腹瀉,精神萎靡、毛色光澤暗淡、嗜睡、活動(dòng)能力減弱等癥狀,攻毒72 h后乳鼠腹瀉最為嚴(yán)重,乳鼠肛門(mén)周圍有大量糞便污染,高劑量組部分乳鼠尾根部發(fā)生潰爛流血;攻毒96 h后乳鼠腹瀉減輕,乳鼠體征狀態(tài)開(kāi)始好轉(zhuǎn);感染120 h后乳鼠腹瀉已經(jīng)基本停止,乳鼠開(kāi)始恢復(fù)到正常狀態(tài)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi),對(duì)照組和低劑量組乳鼠無(wú)明顯腹瀉發(fā)生。乳鼠開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉的時(shí)間及腹瀉的嚴(yán)重程度與感染所使用毒種的劑量呈正相關(guān),毒種的劑量越高,乳鼠出現(xiàn)腹瀉的時(shí)間越早,腹瀉持續(xù)的時(shí)間越長(zhǎng),腹瀉評(píng)分及腹瀉百分比越高(圖1)。乳鼠攻毒后的0到7 d,每天收集乳鼠的糞便,使用輪狀病毒膠體金試劑盒檢測(cè)乳鼠糞便的排毒情況。輪狀病毒膠體金檢測(cè)結(jié)果顯示(表1),在攻毒24 h和72 h后,輪狀病毒陽(yáng)性最強(qiáng),72 h后檢測(cè)逐漸減弱,120 h至144 h膠體金檢測(cè)陰性。ELISA檢測(cè)攻毒24 h后各實(shí)驗(yàn)組每只乳鼠的排毒情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),高劑量攻毒組中乳鼠的最大排毒量可達(dá)1280 EU/mL,中劑量攻毒組中乳鼠的最大排毒量也可達(dá)到320 EU/mL(表2)。

    表1 膠體金檢測(cè)乳鼠糞便中RV抗原結(jié)果

    A:攻毒106PFU/只SA11 72 h 后乳鼠糞便膠體金檢測(cè)結(jié)果; B:攻毒105PFU/只SA-11 72 h 后乳鼠糞便膠體金檢測(cè)結(jié)果; C:攻毒104PFU/只SA11 72 h后膠體金檢測(cè)結(jié)果; D:灌胃PBS乳鼠糞便膠體金檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果以“+”號(hào)表示;陰性結(jié)果以“—”號(hào)表示。根據(jù)滴加糞便上清后,T檢測(cè)帶出現(xiàn)的時(shí)間長(zhǎng)短,將RV抗原的陽(yáng)性強(qiáng)度進(jìn)行劃分:++++≤2 min, 2 min<+++≤4 min, 4 min<++≤6 min, 6 min<+≤10;超過(guò)10 min T檢測(cè)帶出現(xiàn)或不出現(xiàn)都判為—

    A:分別攻毒106PFU/只、105PFU/只和104PFU/只每組乳鼠腹瀉平均分的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;B:分別攻毒106PFU/只、105PFU/只和104PFU/只每組乳鼠腹瀉百分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    圖1攻毒不同劑量每組乳鼠腹瀉平均分及腹瀉百分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    Fig 1 The average score of diarrhea and the percentage of
    diarrhea in each group neonatal mice with different dose

    2.2 攻毒后乳鼠小腸的病理改變

    乳鼠感染輪狀病毒72 h后,解剖乳鼠,采集小腸組織,制做石蠟切片,經(jīng)HE染色觀察小腸的形態(tài)學(xué)改變,輪狀病毒感染組的小腸絨毛可見(jiàn)明顯的腫脹及破損,小腸絨毛頂端可見(jiàn)大量的空泡化細(xì)胞,對(duì)照組未見(jiàn)異常(圖2)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn),與PBS對(duì)照組相比較,輪狀病毒組的小腸絨毛排列紊亂,發(fā)生明顯皺縮以及細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴樣結(jié)構(gòu)(圖3)。

    表2 ELISA檢測(cè)攻毒24 h后乳鼠糞便RV抗原結(jié)果

    ELISA檢測(cè)攻毒24 h后乳鼠糞便RV抗原結(jié)果(單位:EU/mL)。A組:攻毒106PFU/只 糞便ELISA檢測(cè)結(jié)果; B組:攻毒105PFU/只 糞便ELISA檢測(cè)結(jié)果; C組:攻毒104PFU/只 糞便ELISA檢測(cè)結(jié)果; D組:PBS組糞便ELISA檢測(cè)結(jié)果。“—”表示未采到糞便

    2.3 輪狀病毒抗原在各臟器中的分布情況

    在感染輪狀病毒后,于不同時(shí)間點(diǎn)解剖乳鼠,采集相應(yīng)組織,制做冰凍切片,進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在感染RV 24、48、72和96 h后,106PFU SA11組和105PFU SA11組乳鼠的小腸(空腸部位)以及腎臟組織內(nèi)均檢測(cè)到了輪狀病毒抗原抗原(圖4),而104PFU SA11組和PBS對(duì)照組乳鼠的空腸和腎臟組織內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)輪狀病毒抗原。在不同劑量RV感染組中的心、肝、肺等其他組織內(nèi)未檢測(cè)到輪狀病毒抗原(資料未顯示)。

    A:對(duì)照組; B:實(shí)驗(yàn)組(攻毒105PFU/只SA11)。(a):小腸絨毛頂端破損;(b):絨毛空泡變性

    圖2感染RV 72 h后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠小腸病變情況(HE×200)

    Fig 2 The small intestine lesions of the experimental
    group and the control group (HE × 200)

    A、B:對(duì)照組;C:攻毒106PFU/只SA11組;D:攻毒105PFU/只SA11組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比小腸微絨毛發(fā)生明顯縮短,出現(xiàn)大量脂滴結(jié)構(gòu)。(a)(b):小腸微絨毛排列整齊,結(jié)構(gòu)完整;(c):小腸微柔毛脫落;(d):小腸微柔毛皺縮變短、排列紊亂

    圖3小腸電鏡圖片

    Fig 3 Small intestine electron microscopy picture(TEM×20 000)

    2.4 組織細(xì)胞原位凋亡檢測(cè)

    通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組空腸組織原位凋亡檢測(cè),發(fā)現(xiàn)攻毒RV 72 h 后,106PFU/只和105/PFU/只SA11實(shí)驗(yàn)組小腸絨毛頂端細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡,凋亡細(xì)胞沿絨毛頂端成串排列,并可見(jiàn)凋亡細(xì)胞從絨毛上脫落。對(duì)照組和攻毒104PFU/只SA11組未檢測(cè)到明顯的凋亡細(xì)胞(圖5)。

    A:對(duì)照組腎臟;B:攻毒106PFU/只SA11組腎臟;C:對(duì)照組小腸;D:攻毒106PFU/只SA11組小腸

    圖4對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腎臟和小腸組織免疫熒光圖片(免疫熒光×200)

    Fig 4 Immunofluorescence images of renal and small intestine tissues in the
    control and experimental groups (Immunofluorescence×200)

    A:對(duì)照組;B:攻毒104PFU/只SA11組小腸;C:攻毒106PFU/只SA11組小腸;D:攻毒105PFU/只組小腸

    圖5小腸原位凋亡檢測(cè)(免疫熒光×200)

    Fig 5 Detection of apoptosis in small intestine (Immunofluorescence×200)

    3 討論與結(jié)論

    輪狀病毒動(dòng)物模型對(duì)于疫苗的研制與開(kāi)發(fā)、抗病毒藥物的篩選、抗體體內(nèi)的治療、致病機(jī)理的研究等都具有重要的意義。目前輪狀病毒的動(dòng)物模型主要分為兩種,一種是腹瀉模型,如無(wú)菌豬和乳鼠;一種是無(wú)腹瀉癥狀的感染模型,如大鼠、兔子、羊、牛等[8-9]。無(wú)菌豬和乳鼠是目前為止研究較為成功的輪狀病毒模型[10]。李晉濤等采用人源輪狀病毒W(wǎng)a株、G1和G3分別感染巴馬新生仔豬,引起仔豬發(fā)生明顯腹瀉及腸道病理改變,成功構(gòu)建了人源輪狀病毒的腹瀉模型[11]。無(wú)菌豬免疫系統(tǒng)與人類較為接近,且致病周期長(zhǎng),但是對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高,操作起來(lái)較為困難;而乳鼠對(duì)輪狀病毒易感且繁殖能力強(qiáng),易于實(shí)驗(yàn)操作,因此我們選擇了Balb/c乳鼠來(lái)進(jìn)行輪狀病毒的建模。

    乳鼠在攻毒后會(huì)出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)力下降等臨床癥狀,且在24 h內(nèi)出現(xiàn)不同程度的腹瀉,72 h腹瀉最為嚴(yán)重,96 h逐漸減弱,120 h腹瀉完全消失。乳鼠開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉的時(shí)間及腹瀉的嚴(yán)重程度與感染所使用的毒種類別及毒種的劑量有關(guān)。當(dāng)使用同一毒種時(shí),毒種的劑量越高,乳鼠出現(xiàn)腹瀉的時(shí)間越早,腹瀉持續(xù)的時(shí)間越長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn),SA11組中感染106PFU/只和105PFU/只可以使乳鼠發(fā)生明顯的腹瀉;輪狀病毒攻毒后,通過(guò)膠體金及ELISA的方式能夠檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)小鼠腸道有排毒,通過(guò)免疫熒光能夠檢測(cè)到小腸組織內(nèi)有輪狀病毒抗原,表明攻毒感染后輪狀病毒在實(shí)驗(yàn)小鼠腸道組織內(nèi)得到了復(fù)制增殖;另一方面通過(guò)石蠟切片HE染色及電鏡觀察發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)乳鼠小腸的病理組織發(fā)生了明顯的改變,攻毒組的小腸絨毛排列紊亂,發(fā)生明顯皺縮以及小腸絨毛細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡化及脂滴樣結(jié)構(gòu);輪狀病毒感染還能造成小腸部位凋亡細(xì)胞的增加。以上結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了小鼠輪狀病毒感染的腹瀉模型。

    有報(bào)道稱輪狀病毒在一定情況下也可導(dǎo)致腸道外臟器的感染。輪狀病毒感染乳鼠后可穿過(guò)腸道形成病毒血癥,感染腸道外的臟器[12-14]。通過(guò)免疫熒光,我們發(fā)現(xiàn)輪狀病毒感染乳鼠后,部分乳鼠腎臟的腎小球位置能檢測(cè)到輪狀病毒抗原。這說(shuō)明輪狀病毒感染存在病毒血癥,但病毒血癥的發(fā)生與感染的病毒株、感染劑量及乳鼠自身的免疫狀態(tài)等有很大的關(guān)系。譚震在就診的120例輪狀病毒感染的患兒中發(fā)現(xiàn)只有7例發(fā)生了病毒血癥,而Kapion等在經(jīng)輪狀病毒感染的重度免疫缺陷嬰幼兒中發(fā)現(xiàn)均可發(fā)生病毒血癥[15-16]。

    綜上所述,本研究成功構(gòu)建了猴源輪狀病毒SA-11株 Balb/c 乳鼠動(dòng)物模型,為后續(xù)疫苗的研制與開(kāi)發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。但由于乳鼠的致病周期短,無(wú)法長(zhǎng)期觀察其病理過(guò)程,以及其與人的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)和體型過(guò)小等原因并不能完全用于評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。Monica等利用一種新分離的野生型猴源輪狀病毒TUCH灌胃攻毒14~42 d齡的嬰猴,攻毒后雖無(wú)腹瀉發(fā)生,但糞便中檢測(cè)到大量病毒抗原[17]。我們今后也將在恒河猴嬰猴身上展開(kāi)一系列人源輪狀病毒ZTR-68及猴源輪狀病毒SA11的相關(guān)實(shí)驗(yàn),以期建立更為合適的輪狀病毒感染模型,為后續(xù)疫苗保護(hù)性評(píng)價(jià)提供更為完善的理論基礎(chǔ)。

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