大腹園蛛黏液蛋白ASG2 C端功能模塊的克隆表達(dá)及圓二色譜分析

張露， 溫睿， 李雪， 孟清， 林瑛

(1. 東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所； 2. 東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 上海 201620)

蜘蛛可產(chǎn)生6種蛛絲和一種黏合物，包括主壺腹腺絲(MaSp)、次壺腹腺絲(MiSp)、鞭狀腺絲(FlSp)、葡萄狀腺絲(AcSp)、管狀腺絲(TuSp)、梨狀腺絲(PySp)，不同的蛛絲分別具有不同生理功能和材料學(xué)性能，在蜘蛛的生命歷程中扮演著不同的角色[1-8]。如主壺腹腺絲、鞭狀腺絲等，因其優(yōu)異的強(qiáng)度或彈性等材料學(xué)性能在生物材料領(lǐng)域具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值，引起研究者的研究熱潮[9-13]。黏合物(ASG)是由聚狀腺體(aggregate silk gland)分泌，由ASG1和ASG2兩種蛋白組成[14-16]。黏合物能夠形成膠滴，以一定距離附著于鞭狀腺絲的表面，構(gòu)成具有極佳黏性的捕獲絲，能夠黏附獵物，防止其逃脫，對于蜘蛛捕獲獵物具有重要作用[15]。不同于上述幾種蛛絲，黏合物在天然狀態(tài)下不是以絲纖維的形態(tài)存在，因此對其的結(jié)構(gòu)功能研究和仿生應(yīng)用研究較少。

但是現(xiàn)有研究者對黏合物的組分進(jìn)行了探索研究[15]，證明其組份ASG1屬于節(jié)肢動(dòng)物基因家族，編碼圍食基質(zhì)蛋白；而其一個(gè)組份ASG2，其基因結(jié)構(gòu)和序列特征卻與蛛絲蛋白的基因相似，屬于蛛絲蛋白家族，因此ASG2成絲也稱為聚狀腺蛛絲蛋白(aggregate spidroin 1: AgSp1)。同時(shí)也有研究者對AGS2進(jìn)行了外源重組表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AGS2在剪切力的作用下能夠形成絲纖維，也可通過濕紡的方式成絲[14]；并且黏合物有其獨(dú)特的材料學(xué)性能，例如一種圓網(wǎng)蜘蛛角類肥蛛(Larinioidescornutus)的一個(gè)單一膠滴可以承受400 μN(yùn)的拉伸力，其可延展至800 μm3[17]，所以ASG2也具有作為生物材料的潛在應(yīng)用價(jià)值，并且可能提供一種新型生物材料。因此，對AGS2蛋白的結(jié)構(gòu)功能研究和仿生應(yīng)用等方面的探索具有重要意義。

由已報(bào)道的絡(luò)新婦蛛(Nephilaclavipes)的ASG2蛋白的cDNA可知[15-16]，ASG2蛋白同樣可分為N端非重復(fù)區(qū)(NT)、C端非重復(fù)區(qū)(CT)和中間重復(fù)模塊(RP)，這與其他6種蛛絲蛋白的氨基酸序列特征相似[1, 3, 18]。隨著蛛絲蛋白研究的不斷深入，蛛絲蛋白各個(gè)模塊的結(jié)構(gòu)和功能逐漸明了，對于蛛絲的仿生具有重要的指導(dǎo)意義。研究表明，NT主要作用于蛛絲蛋白的高濃度儲(chǔ)存過程[19-20]，RP是蛛絲蛋白成絲的負(fù)責(zé)模塊[21-22]，而CT則是在蛛絲蛋白的成絲過程中具有重要作用[23-25]。目前，僅報(bào)道了MiSp、MaSp、AcSp的CT高級(jí)結(jié)構(gòu)，對其功能也進(jìn)行了闡述[23-26]。研究表明，蛛絲蛋白CT的高級(jí)結(jié)構(gòu)雖具有一定的保守性，但是仍然存在一定的差異，也導(dǎo)致了不同蛛絲蛋白的CT的功能不同。而對ASG2 CT的結(jié)構(gòu)功能的相關(guān)研究更是少數(shù)，因此ASG2 CT編碼基因材料的獲取、結(jié)構(gòu)功能的研究是非常必要的，這是后續(xù)ASG2蛋白仿生應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。

因此，為了豐富ASG2 CT的編碼基因材料，我們利用錨定PCR方法，在本研究中首次獲取了大腹園蛛(Araneusventricosus) ASG2的C端非重復(fù)區(qū)編碼基因AvAGS2CT，并在大腸桿菌中對其進(jìn)行了重組表達(dá)；進(jìn)一步利用圓二色譜(CD)，對AvAGS2CT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探索分析，這為后續(xù)的ASG2 CT高級(jí)結(jié)構(gòu)解析和功能研究奠定了基礎(chǔ)，例如為探索ASG2 CT在ASG2成絲過程中的作用等提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒等購于生工生物工程股份有限公司(上海，中國)；PCR相關(guān)試劑購于NEB公司(美國)；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶購于天根生化科技有限公司(北京，中國)；Thermo Fisher Scientific公司(美國)；表達(dá)宿主E.coli(DH5α和BL21)購于天根生化科技有限公司(北京，中國)；蛋白純化相關(guān)試劑購于Qiagen公司(德國)；Western-blot相關(guān)試劑購于Invitrogen 公司(美國)；引物合成和基因測序反應(yīng)在上海睿迪生物有限公司進(jìn)行(上海，中國)。

1.2 克隆構(gòu)建

1.2.1 目的基因的獲取

根據(jù)NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中一段EST序列(expressed sequence tag sequences) (GenBank: AT006577.1)設(shè)計(jì)兩條同向特異性外側(cè)引物Av glue F1和內(nèi)側(cè)引物Av glue F2，同時(shí)設(shè)計(jì)接頭引物AL和AS(序列見表1)。具體錨定PCR步驟：提取大腹園蛛基因組DNA為模板，加入外側(cè)特異性引物Av glue F1進(jìn)行單引物擴(kuò)增，PCR條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃再延伸10 min，35個(gè)循環(huán)；隨后對回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行加尾，利用TdT末端加尾酶進(jìn)行在PCR產(chǎn)物的3′端加C，反應(yīng)條件如下：PCR回收產(chǎn)物19 μL，TdT末端加尾酶buffer 9 μL，dCTP 1 μL，TdT末端加尾酶1μL，置于37℃，反應(yīng)15 min；回收加尾產(chǎn)物，并以此為模板，加入外側(cè)特異性引物Av glue F1和接頭引物AL進(jìn)行常規(guī)PCR，PCR條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃再延伸10 min，35個(gè)循環(huán)。取1 μL上述PCR產(chǎn)物作為模板，加入內(nèi)側(cè)特異性引物Av glue F2和接頭引物AS進(jìn)行常規(guī)PCR，PCR條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃再延伸10 min，35個(gè)循環(huán)；進(jìn)行第二次常規(guī)PCR；隨后對該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收，送上海睿迪生物有限公司進(jìn)行測序。將上述測序結(jié)果與NCBI中已知ASG2序列進(jìn)行拼接，得到大腹園蛛ASG2 CT的完整編碼序列AvASG2CT序列。

表1 引物序列

注：下劃線所示為限制性酶切位點(diǎn)

1.2.2 重組質(zhì)粒的克隆構(gòu)建

根據(jù)上述獲得的目標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物Glue2CT-P1和Glue2CT-P2，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，PCR條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃再延伸10 min，35個(gè)循環(huán)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并進(jìn)行BamH I和XhoI雙酶切；同時(shí)對修飾過的pet-32表達(dá)質(zhì)粒載體pet-M (含有6His-tag和凝血酶位點(diǎn))進(jìn)行BamH I和XhoI雙酶切；利用T4連接酶連接目標(biāo)插入片段與質(zhì)粒表達(dá)載體得到重組表達(dá)質(zhì)粒pet-M-AvAGS2CT；轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5α，進(jìn)行平板過夜培養(yǎng)；挑取單克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，抽取質(zhì)粒后，再進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定，最后將陽性克隆送往上海睿迪生物有限公司進(jìn)行測序。

1.3 序列分析

利用ClustalW2對AvASG2CT序列與已知的同源序列進(jìn)行比對分析，已知的同源序列從NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得，其GenBank號(hào)等詳細(xì)信息見表2；利用psipred網(wǎng)站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)對AvASG2CT進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用Geneious7軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(phylogenetic tree)分析。

表2 已報(bào)道的AGS2 CT序列

1.4 目標(biāo)蛋白表達(dá)純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒pet-M-AvAGS2CT，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，進(jìn)行平板過夜培養(yǎng)；挑取單克隆，接種于10 mL LB中，37℃、200 r/min進(jìn)行過夜培養(yǎng)；隨后轉(zhuǎn)接于1 L LB中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃、200 r/min，培養(yǎng)至OD600約0.6～0.8，加入終濃度0.3 mmol/L的IPTG，20℃、200 r/min，進(jìn)行過夜誘導(dǎo)表達(dá)；上述所用到的液體LB培養(yǎng)基中均含有終濃度100 μg/mL的Amp (氨芐青霉素)。

4000 r/min、20 min離心收集過夜誘導(dǎo)的菌體，加入50 mL lysis buffer (20 mmol/L Tris，pH 8.0)進(jìn)行重懸；隨后利用高壓破碎儀JN-3000 plus (廣州，中國)進(jìn)行菌體破碎，1200 bar；后10 000 r/min、40 min離心收集上清；根據(jù)Qiagen鎳柱使用說明進(jìn)行目標(biāo)蛋白純化，將上清與Ni-NTA柱子結(jié)合，利用wash buffer (20 mmol/L Tris，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0)，對柱子進(jìn)行沖洗，利用elute buffer (20 mmol/L Tris，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0)對目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫；隨后在收集的目標(biāo)蛋白中加入凝血酶，以切除目標(biāo)蛋白上的6His-tag，同時(shí)透析于2 L 10 mmol/L PB buffer (pH 7.0)中，每2 h換一次buffer，重復(fù)3次，以透析去除咪唑。

1.5 目標(biāo)蛋白檢測

利用15%的SDS-PAGE檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)純化情況；利用6His-tag的特異性抗體對目標(biāo)蛋白進(jìn)行Western-blot免疫印跡，以對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定性；Western-blot操作步驟按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行，一抗(6His-tag的特異性抗體)以1∶5000加入；特異性的二抗以1∶5000加入；加入Invitrogen的ECL底物進(jìn)行顯色反應(yīng)；后進(jìn)入暗室壓片。

1.6 圓二色譜測試

對目標(biāo)蛋白AvAGS2CT進(jìn)行了圓二色譜(CD)測試，將透析后的目標(biāo)蛋白以0.5 mg/mL的終濃度利用 (Jasco J-810 spectropolarimeter)進(jìn)行CD測試，條件如下：25℃，掃描波長190～260 nm，0.1 mm比色皿，wavelength step 1 nm，掃3次平均，得到CD圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)基因AvASG2CT的獲取

為獲取大腹園蛛(Araneusventricosus)黏合蛋白(聚合腺絲)ASG2的CT的編碼基因，利用其同源序列十字園蛛(Araneusdiadematus)的AGS2部分編碼序列(GenBank No KU132350.1)在NCBI中進(jìn)行序列搜索，找到一段EST序列(GenBank No.AT006577.1)，該EST序列屬于大腹園蛛的cDNA文庫；通過序列比對分析，兩個(gè)序列的同源性可達(dá)89%，因此推測該段EST序列為大腹園蛛ASG2的部分編碼基因。所以，根據(jù)該段EST序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行單引物擴(kuò)增，利用接頭引物，進(jìn)行兩輪常規(guī)PCR擴(kuò)增。由圖1-A可見，目標(biāo)條帶被特異性擴(kuò)增。但是由于模板是將單引物擴(kuò)增產(chǎn)物，利用TdT末端加dCTP后所得到的，所以PCR擴(kuò)增得到的條帶大小不一；因此，將圖1-A中較亮的條帶約900 bp膠回收后，進(jìn)行測序反應(yīng)。

A：單引物擴(kuò)增后的第二輪PCR結(jié)果圖，M: DNA ladder；lane 1～6：第二輪PCR結(jié)果。B：以基因組為模板PCR擴(kuò)增AvASG2CT序列結(jié)果圖，M: DNA ladder；lane 1-3：PCR平行樣；lane 4：陰性對照

圖1AvASG2CT基因序列獲取PCR結(jié)果圖

Fig 1 The PCR results of theAvASG2CTgene obtaining

黑色框所示為AvASG2CT的終止密碼子；紅色框所示為AATAAA保守元件

圖2單引物擴(kuò)增獲得的AvASG2CT下游編碼序列

Fig 2 The downstream sequence of theAvASG2CT
from the single primer PCR

圖2展示了上述測序結(jié)果，分析序列可知，在開放閱讀框的后方發(fā)現(xiàn)了終止密碼子(圖2中黑色方框所示)，且在其下游序列發(fā)現(xiàn)了AATAAA保守元件(圖2中紅色方框所示)，其為轉(zhuǎn)錄成mRNA ployA的保守性元件[27]。因此，可以初步確定獲得了大腹園蛛ASG2 CT的下游完整編碼序列。

將測序結(jié)果與NCBI中已知的序列(GenBank No.AT006577.1)進(jìn)行拼接后，得到完整的AvASG2CT編碼序列，其氨基酸序列如圖3中三角所示。隨后，根據(jù)該編碼序列設(shè)計(jì)特異性引物Glue2CT-P1和Glue2CT-P2，以基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對該序列進(jìn)行回歸驗(yàn)證，如圖1(B)所示，得到了特異性的目標(biāo)條帶，條帶大小與理論值398 bp相符；將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體pet-M中得到pet-M-AvAGS2CT，挑取陽性重組子進(jìn)行測序，將得到的序列與上述單引物擴(kuò)增得到序列進(jìn)行比對分析可知，兩次得到的序列完全一致，因此可確定成功獲取了大腹園蛛AvASG2CT的完整編碼序列。

圓柱示為 5 個(gè) α-helix (H1-H5)；AvASG2CT序列為三角形所示

圖3不同蜘蛛種屬的ASG2 CT序列比對分析

Fig 3 The sequence align of the CT of ASG2 from different spider species

將獲得的AvASG2CT序列與現(xiàn)今已報(bào)道的AGS2 CT序列進(jìn)行比對分析可知， 不同種屬的蜘蛛的ASG2 CT，在初級(jí)結(jié)構(gòu)上具有較高的保守性，同源性可達(dá)55%。其中，本次獲得的AvASG2CT序列與十字園蛛(Araneusdiadematus)ASG2 CT(圖3中序列A.d.ASG2)的序列保守性可達(dá)92%，與黑寡婦蜘蛛(Latrodectushesperus) ASG2 CT(圖3中序列L.h.ASG2)的序列保守性可達(dá)44.8%，與絡(luò)新婦蛛(Nephilaclavipes) ASG2 CT(圖3中序列N.c.ASG2)的序列保守性可達(dá)63.2%，與格羅薩肥腹蛛(Steatodagrossa) ASG2 CT(圖3中序列S.g.ASG2)的序列保守性可達(dá)41.6%。

AvASG2CT蛋白序列由三角形所示

圖4不同種屬蜘蛛的ASG2 CT進(jìn)化樹分析

Fig 4 The phylogenetic tree of CT of ASG2 from different spider species

同時(shí)，將獲得的AvASG2CT與已報(bào)道的其他種屬蜘蛛的ASG2 CT進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。由系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖4)可知，AvASG2CT與十字園蛛(Araneusdiadematus)的親緣關(guān)系最為相近，與上述序列保守性分析一致。因此，通過上述基因組PCR驗(yàn)證及序列比對分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可確定獲得的AvASG2CT序列即為大腹園蛛AGS2 CT的編碼序列。

2.2 AvASG2CT蛋白的克隆表達(dá)

將重組質(zhì)粒pet-M-AvAGS2CT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，外源表達(dá)AvAGS2CT蛋白。pet-M質(zhì)粒載體源于改造過的pet-32系列載體，其含有純化標(biāo)簽6His-tag，可用于鎳柱純化和免疫印跡分析；且6His-tag標(biāo)簽下游即為凝血酶位點(diǎn)，可用于切除標(biāo)簽，以去除標(biāo)簽對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的影響。

利用鎳柱對目標(biāo)蛋白AvAGS2CT進(jìn)行親和純化，純化結(jié)果如圖5中SD-PAGE (Coomassie strained)所示，lane I為誘導(dǎo)后總蛋白樣，在14.4 ku marker大小處，與誘導(dǎo)前總蛋白樣lane N相比，出現(xiàn)大量表達(dá)的條帶，與目標(biāo)蛋白AvAGS2CT理論值15.3 ku相符，說明AvAGS2CT蛋白成功在大腸桿菌BL21中得到大量表達(dá)，且絕大部分在上清中(lane S)，沉淀中幾乎沒有目標(biāo)蛋白的存在(lane P)，說明目標(biāo)蛋白以可溶的形式存在于上清中，同時(shí)也說明菌體破碎得較為徹底；用含有20 mmol/L咪唑的wash buffer對鎳柱中的非特異性結(jié)合的雜蛋白進(jìn)行沖洗，如lane W所示，泳道中既沒有雜蛋白的存在也沒有出現(xiàn)目標(biāo)蛋白，說明雜蛋白洗脫效果較好；隨后利用含有250 mmol/L咪唑的elution buffer對目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫收集，如lane E1所示，所獲得的目標(biāo)蛋白純度可達(dá)90%以上。由序列分析可知，目標(biāo)蛋白AvAGS2CT序列中含有一個(gè)半胱氨酸Cys，推測可形成分子間二硫鍵，因此制備了非還原樣E1′(不含有還原劑DTT等)，如lane E1′所示，確實(shí)有部分目標(biāo)蛋白AvAGS2CT形成了二聚體。為去除6His-tag，以減少其對目標(biāo)蛋白AvAGS2CT結(jié)構(gòu)功能的影響，利用凝血酶在透析過程中，對純化標(biāo)簽進(jìn)行切除，如lane T所示，去除標(biāo)簽后目標(biāo)蛋白符合理論值大小13.7 ku，表明6His-tag成功從目標(biāo)蛋白被切除；目標(biāo)蛋白經(jīng)過鎳柱親和純化和標(biāo)簽切除，最終的產(chǎn)量約75 mg/mL。經(jīng)過透析和標(biāo)簽切除的目標(biāo)蛋白樣品用于后續(xù)的CD測試。

同時(shí)，為了對目標(biāo)蛋白AvAGS2CT(未切除6His-tag的目標(biāo)蛋白樣E1)進(jìn)行定性分析，利用6His-tag的特異性的抗體，對其進(jìn)行了Western-blot檢測。如圖5所示(Anti His)，經(jīng)過免疫印跡成功檢測到了目標(biāo)條帶的存在，且條帶位置大小與理論值相符，因此，可進(jìn)一步證明目標(biāo)蛋白AvAGS2CT成功在體外得到表達(dá)純化。

M：蛋白質(zhì)marker；N：誘導(dǎo)前；I：誘導(dǎo)后；P：沉淀；S：上清；FT：穿柱液；W：沖洗；E1：洗脫樣；E1′：還原樣；T1：去標(biāo)簽樣；T1′：去標(biāo)簽還原樣

圖5AvAGS2CT蛋白表達(dá)的SDS-PAGE和Western-blot分析

Fig 5 SDS-PAGE and Western-blot analysis of the expression of AvAGS2CT

圖6 AvASG2CT的CD圖譜

2.3 AvASG2CT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

為分析AvASG2CT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，首先對其進(jìn)行預(yù)測，由預(yù)測結(jié)果可知，AvASG2CT蛋白包含5個(gè)α-helix (H1-H5)，圖3中紅色圓柱所示。隨后，對AvASG2CT蛋白進(jìn)行CD測試，以檢測其二級(jí)結(jié)構(gòu)。其CD圖譜顯示(圖6)，AvASG2CT蛋白在193 nm處有正吸收峰，在208 nm和222 nm處有負(fù)吸收峰，均為α-helix的特征吸收峰；該圖譜顯示AvASG2CT蛋白在溶液中以α-helix的構(gòu)象存在，與預(yù)測結(jié)果相符。

3 討論與結(jié)論

蛛絲蛋白的末端重復(fù)模塊NT和CT，在蛛絲蛋白的高濃度儲(chǔ)存和成絲過程中扮演著重要角色。目前，僅有MaSp (主壺腹腺絲蛋白)的NT的高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能得到解析，研究表明其單體包含5個(gè)α-helix，以同向平行二聚體的形式，在pH值依賴條件下，在蛛絲蛋白儲(chǔ)存和成絲過程中發(fā)揮作用[20, 28]。而蛛絲蛋白的CT則主要是在成絲過程中發(fā)揮作用，已報(bào)道的CT結(jié)構(gòu)表明，不同蛛絲蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的保守性，其單體均包含5個(gè)α-helix，以同向平行的方式發(fā)揮功能；但是其結(jié)構(gòu)仍具有一定的差異，且功能也各不相同。如，MaSp的CT二聚體以鹽鍵和二硫鍵維持結(jié)構(gòu)，能夠影響主壺腹腺絲蛋白重復(fù)模塊的成絲質(zhì)量，融合CT的重復(fù)模塊形成的絲纖維更為有序[24]；MiSp的CT二聚體以分子間疏水作用力維持其結(jié)構(gòu)，在次壺腹腺絲蛋白的成絲過程扮演著晶核的作用，能夠觸發(fā)絲纖維的形成[25]；AcSp的CT二聚體同樣以鹽鍵等分子間作用力維持結(jié)構(gòu)，對葡萄狀腺絲蛋白重復(fù)模塊具有調(diào)控作用，但是有無CT，葡萄狀腺絲蛋白重復(fù)模塊形成的絲纖維沒有較大的差異[29]。因此，可以看出雖然CT的高級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的保守性，但是其結(jié)構(gòu)和功能卻不盡相同；所以研究不同蛛絲蛋白的CT結(jié)構(gòu)功能研究是非常重要的，這是蛛絲蛋白的仿生應(yīng)用的所必須的。

但是迄今為止，關(guān)于ASG2的研究非常少，尤其是關(guān)于ASG2的結(jié)構(gòu)功能研究和仿生應(yīng)用。目前已經(jīng)證明，ASG2屬于蛛絲蛋白類[15]，且已有研究者嘗試對ASG2進(jìn)行重組表達(dá)，表明ASG2具有形成絲纖維的潛能[14]。由已發(fā)表的絡(luò)新婦蛛(Nephilaclavipes) ASG2的cDNA序列可知[14, 16]，ASG2的重復(fù)模塊不同于MaSp含有大量的polyA模塊，也不同于鞭狀腺蛛絲蛋白(FlSp)含有大量的GPGGX和GGA模塊，造成重組的MaSp或FlSp外源表達(dá)非常困難，且表達(dá)產(chǎn)量較低，而ASG2的重復(fù)模塊不含上述序列，推測其表達(dá)產(chǎn)量會(huì)有所提高，且材料學(xué)性能方面可能相對于其他種蛛絲也可能會(huì)有新的發(fā)現(xiàn)，因此，ASG2具有作為一種新的仿生蛛絲材料的潛在應(yīng)用價(jià)值。為了ASG2后續(xù)的仿生應(yīng)用，ASG2的結(jié)構(gòu)功能研究是非常必要的，尤其是對ASG2末端非重復(fù)功能模塊NT和CT的結(jié)構(gòu)功能的研究，是探索ASG2成絲機(jī)理的首要條件。

為了獲取大腹園蛛ASG2 CT的編碼基因，首先根據(jù)ASG2的同源基因在EST文庫中進(jìn)行了同源搜索，確定了大腹園蛛ASG2 CT的一段編碼序列，并根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行了單引物擴(kuò)增，利用接頭引物經(jīng)過巢式PCR，最終獲得了大腹園蛛ASG2 CT的下游完整編碼序列。為了保證序列可靠性，再次根據(jù)獲得的序列涉及特異性引物，以基因組為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，測序結(jié)果表明，兩次得到的ASG2 CT編碼基因序列完全保持一致。同時(shí)經(jīng)過后續(xù)不同種屬蜘蛛ASG2 CT的同源性比對分析及進(jìn)化樹分析，可以充分確定本次實(shí)驗(yàn)所獲取大腹園蛛ASG2 CT的編碼基因的可靠性，豐富了ASG2 CT的基因序列資源；同時(shí)對AvASG2CT蛋白進(jìn)行外源表達(dá)純化，可用于后續(xù)的ASG2成絲機(jī)理及仿生研究。

現(xiàn)有的研究表明，蛛絲蛋白的CT結(jié)構(gòu)包含5個(gè)α-helix，對大腹園蛛ASG2 CT即AvASG2CT的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，表明其也包含5個(gè)α-helix；同時(shí)其CD圖譜呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的α-helix結(jié)構(gòu)特征峰，表明AvASG2CT蛋白在pH 7.0的磷酸鹽buffer中維持著α-helix結(jié)構(gòu)，與已報(bào)道的CT結(jié)構(gòu)保持一致。本研究僅對AvASG2CT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探索，但是其高級(jí)結(jié)構(gòu)解析、二聚化機(jī)制及在成絲過程中所扮演的角色等都需要進(jìn)一步的探索。

本研究首次獲得了大腹園蛛(Araneusventricosus) ASG2 CT的完整編碼基因AvASG2CT，通過單引物擴(kuò)增和巣式PCR，獲得了大腹園蛛ASG2 CT的完整編碼基因，并經(jīng)過基因組PCR驗(yàn)證、同源序列比對分析和進(jìn)化樹分析，確定了ASG2 CT編碼基因AvASG2CT的可靠性；隨后對AvASG2CT進(jìn)行克隆表達(dá)，利用鎳柱進(jìn)行親和純化，及凝血酶對親和標(biāo)簽進(jìn)行切除，最終其在大腸桿菌BL21中的產(chǎn)量可達(dá)75 mg/L；同時(shí)，本研究對大腹園蛛ASG2 CT的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步的探索，AvASG2CT蛋白的CD圖譜顯示，AvASG2CT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在pH 7.0的磷酸鹽buffer中主要呈現(xiàn)α-helix結(jié)構(gòu)；這是首次對ASG2 CT的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探索，目前尚無ASG2 CT結(jié)構(gòu)功能等相關(guān)研究的報(bào)道。本研究為ASG2 CT的研究提供了基因材料，為ASG2 CT高級(jí)結(jié)構(gòu)解析和功能研究，以及后續(xù)ASG2蛛絲蛋白的成絲機(jī)理研究和仿生應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。