塊菌多糖復(fù)合酶法提取工藝優(yōu)化

清 源陳甜甜,2

QING Yuan1 CHEN Tian-tian1,2

(1. 西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013；2. 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610000)

(1. Department of Agricultural Science of Xi Chang University, Xichang, Sichuan 615013, China; 2. School of Food and Bioengineering of Xihua University, Chengdu, Sichuan 610000, China)

塊菌(Truffles)又名松露、無娘果等，屬于塊菌科(Tuberaceae Dumort)塊菌屬(TuberMicheli)。塊菌中富含氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、雄烷醇、微量元素等生理活性成分，具有提高機體免疫力、抗腫瘤等保健功效，是典型的藥食同源真菌[1-3]。中國商業(yè)塊菌品種包括印度塊菌(T.indicum)、夏塊菌(T.aestivum)等，主要產(chǎn)自西南山區(qū)的四川和云南[4-6]。研究[7-9]表明，塊菌的很多生物學(xué)功效都與其多糖密切相關(guān)。

目前，常用的多糖提取方法主要有熱水浸提法、微波輔助法、超聲波輔助法、酶法等[10]。利用不同方法制備多糖的得率、糖含量、單糖組分等大不相同[11]。其中，熱水浸提法耗時長、提取效率低，且液體量太大不宜處理；微波和超聲波輔助提取，不僅會影響多糖空間微結(jié)構(gòu)，也容易導(dǎo)致多糖化學(xué)鍵斷裂和相對分子質(zhì)量降低，從而對多糖的抗氧化等生物學(xué)活性造成影響[12-13]。目前，利用生物酶提取多糖的方法已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，此法具有成本低和使用方便的優(yōu)點[14]，與超聲波和微波輔助提取方法在大規(guī)模生產(chǎn)時的局限性相比，其反應(yīng)條件溫和，對多糖結(jié)構(gòu)的破壞較少，對設(shè)備和工藝的要求也較低。此前已有酶解提取塊菌多糖的研究，但均采用單一酶法輔助提取[15-16]。

由于不同的酶作用位點不同，復(fù)合酶解作用效率更高[17]。通常多糖被包裹在植物細(xì)胞壁內(nèi)，纖維素酶能破壞細(xì)胞壁，使多糖易于從胞內(nèi)釋放。蛋白酶對細(xì)胞中游離的蛋白質(zhì)具有分解作用，并水解糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)，有利于多糖的浸出。本研究選用中性蛋白酶和纖維素酶輔助提取塊菌多糖，并采用均勻試驗設(shè)計法優(yōu)選復(fù)合酶解工藝，以期獲得高效溫和的提取條件，避免超聲波或微波對多糖結(jié)構(gòu)與活性的影響，為塊菌多糖結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

印度塊菌：購自四川會東；

纖維素酶(3 units/mg)、中性蛋白酶(60 000 U/g)：北京索萊寶科技有限公司；

鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、混合磷酸鹽、鄰苯二甲酸氫鉀等：分析純。

1.2 儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9023MBE型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；

粉碎機：DC-200型，浙江武義鼎盛日用金屬制品廠；

紫外可見分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

pH計：PHS-3C型，上海精密儀器儀表有限公司；

恒溫水浴鍋：HW.SY21-K4C型，北京市長鳳儀器儀表公司；

分析天平：ME204型，梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖提取工藝

塊菌→干燥(55 ℃)→粉碎(過60目篩)→干粉→加蒸餾水→調(diào)pH→酶解→沸水滅酶(10 min)→冷卻→真空抽濾→濾液→沉淀物二次提取→合并2次濾液→定容(80 mL)→塊菌粗多糖溶液→苯酚-硫酸法測多糖含量

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

(1) 酶配比對塊菌多糖得率的影響：設(shè)定酶用量為2.5%，酶解時間65 min，酶解溫度55 ℃，酶解pH值6.0，料液比1∶40 (g/mL)，探討酶配比(中性蛋白酶∶纖維素酶)分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/g)時對塊菌多糖得率的影響。

(2) 酶解時間對塊菌多糖得率的影響：設(shè)定酶配比1∶4 (g/g)，酶用量2.5%，酶解溫度55 ℃，酶解pH值6.0，料液比1∶40 (g/mL)，探討酶解時間分別為45，65，85，105，125 min 時對塊菌多糖得率的影響。

(3) 酶解溫度對塊菌多糖得率的影響：設(shè)定酶配比1∶4 (g/g)，酶用量2.5%，酶解時間65 min，酶解pH值6.0，料液比1∶40 (g/mL)，探討酶解溫度分別為45，50，55，60，65 ℃時對塊菌多糖得率的影響。

(4) 酶用量對塊菌多糖得率的影響：設(shè)定酶配比1∶4 (g/g)，酶解時間65 min，酶解溫度55 ℃，酶解pH值6.0，料液比1∶40 (g/mL)，探討酶用量分別為1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%時對塊菌多糖得率的影響。

(5) 酶解pH值對塊菌多糖得率的影響：設(shè)定酶配比1∶4 (g/g)，酶用量2.5%，酶解時間65 min，酶解溫度55 ℃，料液比1∶40 (g/mL)，探討酶解pH值分別為4.5，5.0，5.5，6.0，6.5時對塊菌多糖得率的影響。

(6) 料液比對塊菌多糖得率的影響：設(shè)定酶配比1∶4 (g/g)，酶用量2.5%，酶解時間65 min，酶解溫度55 ℃，酶解pH值6.0，探討料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)時對塊菌多糖得率的影響。

1.3.3 均勻設(shè)計試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按照U10(108)進(jìn)行均勻設(shè)計試驗，得出塊菌多糖的最佳復(fù)合酶解工藝。

1.3.4 塊菌多糖含量的測定 采用硫酸-苯酚法[18]。

(1) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=6.425 7X+0.291 7，R2=0.999 5。

(2) 塊菌多糖含量的計算：

(1)

式中：

A——塊菌多糖含量，%；

Y——塊菌多糖溶液濃度，mg/mL；

V——多糖溶液體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

N——多糖粗提物質(zhì)量，g。

1.3.5 塊菌多糖得率的計算

(2)

式中：

B——塊菌多糖得率，%；

Y——塊菌多糖溶液濃度，mg/mL；

V——多糖溶液體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

M——塊菌干粉質(zhì)量，g。

1.3.6 試驗統(tǒng)計與分析 運用DPS 9.50軟件對均勻試驗結(jié)果進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶配比對多糖得率的影響 由圖1可知，塊菌多糖得率隨中性蛋白酶與纖維素酶配比的逐漸增大先升高，在1∶4 (g/g)時達(dá)到最高，之后呈現(xiàn)下降趨勢。纖維素酶能有效地分解或破壞細(xì)胞壁，中性蛋白酶能有效酶解與多糖結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)，從而更有利于多糖的提取[19]。故提取塊菌多糖的最適酶配比為1∶4 (g/g)。

2.1.2 酶解時間對多糖得率的影響 由圖2可知，隨著酶解時間的延長，多糖得率提高，在65 min處達(dá)到最大，之后再延長時間，多糖得率下降。酶解時間太短，底物不能被充分酶解；時間太長，高溫使得被提取出來的多糖分解，或者高溫導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使多糖得率降低。提取塊菌多糖的最佳酶解時間為65 min。

圖1 酶配比對多糖得率的影響

圖2 酶解時間對多糖得率的影響

2.1.3 酶解溫度對多糖得率的影響 由圖3可知，塊菌多糖的得率隨著溫度的升高先增加，在55 ℃處達(dá)到最大，之后呈下降的趨勢。因溫度較低時，達(dá)到反應(yīng)所需的活化能較困難，因而反應(yīng)速度較慢，多糖的得率也較低；當(dāng)溫度較高時，酶活性喪失，反應(yīng)速率減慢，多糖得率也低。故提取塊菌多糖的最合適酶解溫度為55 ℃。

2.1.4 酶用量對多糖得率的影響 由圖4可知，塊菌多糖的得率隨酶用量的增加先增加，在2.5%處達(dá)到最大，之后多糖得率減少。因酶用量較低時，2種酶不能完全使結(jié)合在一起的多糖和蛋白質(zhì)分開，因而多糖提取率較低；當(dāng)酶用量較高時，由于酶分子已經(jīng)達(dá)到飽和，一部分酶分子不能與底物結(jié)合，底物被水解的速率下降，多糖得率減少。故提取塊菌多糖的最適酶用量為2.5%。

圖3 酶解溫度對多糖得率的影響

圖4 酶用量對多糖得率的影響

2.1.5 pH值對多糖得率的影響 由圖5可知，pH值從4.5增加至6.0塊菌多糖的得率隨之增加，當(dāng)pH值為6.0時塊菌多糖的得率達(dá)到最高，之后開始降低。因pH較低時，中性蛋白酶的活性受到抑制；同樣當(dāng)pH>6.0時，纖維素酶的活性受到抑制。故提取塊菌多糖的最適pH值為6.0。

圖5 pH值對多糖得率的影響

2.1.6 料液比對多糖得率的影響 由圖6可知，塊菌多糖的得率隨料液比的增加呈先上升的趨勢，在1∶40 (g/mL)處達(dá)到最大值，隨后開始下降?？赡苁钱?dāng)料液比較小時，短時間內(nèi)多糖的浸出受到抑制，所以得率較低；而料液比較大時，水分的增加使酶的濃度降低，多糖得率也會降低[8]。故提取塊菌多糖的最合適料液比為1∶40 (g/mL)。

圖6 料液比對多糖得率的影響

2.2 均勻試驗

2.2.1 均勻設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇酶配比、酶解時間、酶解溫度、酶用量、pH值和料液比6個因素的較優(yōu)水平(見表1)，按照U10(108)設(shè)計進(jìn)行均勻試驗。

2.2.2 均勻試驗結(jié)果與分析 按照優(yōu)化之后的數(shù)據(jù)點，每次提取塊菌干粉1.0 g，根據(jù)選定的均勻設(shè)計表，得出試驗結(jié)果見表2。運用DPS 9.50軟件進(jìn)行二次多項式回歸分析得到回歸方程為：

(3)

對建立的模型進(jìn)行檢驗可知，F(xiàn)=3 240.488 6>>F0.01(7,2) =99.34, P=0.000 3，說明結(jié)果顯著(P<0.05)。復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.999 956，剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=0.009 4。說明該模型與實際試驗擬合度高，能很好地擬合復(fù)合酶法提取塊菌多糖的工藝條件，方程有意義。

表1 均勻設(shè)計試驗因素與水平表

表2 均勻設(shè)計試驗結(jié)果

表3 相關(guān)系數(shù)及檢驗結(jié)果

同時，用DPS軟件進(jìn)行分析得到復(fù)合酶法提取塊菌多糖的最優(yōu)條件為：酶配比1∶7.03 (g/g)，酶解時間47.60 min，酶解溫度41.29 ℃，酶用量為底物濃度的3.62%，pH值4.79，料液比1∶29.08 (g/mL)時，塊菌多糖的理論得率為14.98%。

2.3 最佳工藝的確定及驗證

為操作方便，設(shè)置最佳提取工藝條件為：酶配比1∶7 (g/g)，酶解時間48 min，酶解溫度41 ℃，酶用量為底物濃度的3.6%，pH值4.8，料液比1∶29 (g/mL)。按上述條件進(jìn)行驗證，實驗重復(fù)3次。

經(jīng)驗證，優(yōu)化條件下提取的塊菌多糖得率為14.50%，比均勻試驗中的10組試驗結(jié)果都高，說明優(yōu)化結(jié)果具有指導(dǎo)意義。但是與回歸模型的預(yù)測值14.98%有一定的誤差，相對誤差為3.3%。在此條件下，塊菌多糖含量可達(dá)75.96%。與前人[15,20]研究相比，該塊菌多糖提取溫度更低，時間更短，耗能更少，提取效率更高。

2.4 不同提取方法的比較

不加酶的對照試驗，提取的塊菌多糖得率僅為9.45%，復(fù)合酶法與之相比提高了53.44%；單一使用中性蛋白酶和纖維素酶的多糖得率僅為10.87%和11.43%。說明均勻設(shè)計優(yōu)化多糖提取條件穩(wěn)定性好，且非?？煽?，可用于復(fù)合酶法提取塊菌多糖。

3 結(jié)論

本研究通過單因素和均勻設(shè)計試驗，得出塊菌多糖最佳提取工藝條件為：酶配比1∶7 (g/g)，酶解時間48 min，酶解溫度41 ℃，酶用量3.6%，酶解pH值4.8，料液比1∶29 (g/mL)，塊菌多糖的得率可達(dá)14.50%，多糖含量可達(dá)75.96%。應(yīng)用此條件提取塊菌多糖穩(wěn)定可靠，提取時間短，還節(jié)能減排，可為塊菌多糖的開發(fā)利用提供參考。但是，本研究方法所得塊菌多糖的純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性等還有待進(jìn)一步研究。