棉花輪紋斑病接種方法的優(yōu)化

王婧 ，翟偉卜 ，孟菁 ，高環(huán) ，史金艷 ，張文蔚 ，韓榕 ，齊放軍 *

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004）

鏈格孢（Alternaria alternata）引起的棉花輪紋斑病又叫黑斑病 （Alternaria leaf spot,Black leaf spot），可全生育期危害棉花葉片，且發(fā)生范圍廣、危害嚴(yán)重、流行頻率高[1-2]。該病在我國(guó)各棉區(qū)均有發(fā)生，尤其在陰濕多雨的氣候條件下更易暴發(fā)流行，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致棉株葉片全部脫落成光稈，甚至枯死，在早發(fā)和重發(fā)田塊可降低產(chǎn)量30%～50%，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。1995―1998年在新疆南疆的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)大種植的海島棉品種在后期極易發(fā)生輪紋斑病，特別是鈴期至吐絮期尤為嚴(yán)重，并有逐漸加重的趨勢(shì)[5]。2001年河北省館陶縣棉花輪紋斑病發(fā)生面積超過3 000 hm2，當(dāng)?shù)孛揶r(nóng)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[6]。湖北省鄂州市植物保護(hù)站經(jīng)過長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，2005年前由鏈格孢屬真菌引起的棉花輪紋斑病還屬當(dāng)?shù)氐拇我『?，?005年之后，該病逐年加重，已成為該市的主要病害[7]。筆者團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，棉花生長(zhǎng)中后期，低溫會(huì)降低棉花的抗病性，導(dǎo)致棉花葉片易遭受鏈格孢菌的侵染，輪紋斑病暴發(fā)引起棉花早衰，從而對(duì)棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失[8]。Venkatesh等[9]也證明氣候?qū)γ藁ㄝ喖y斑病的發(fā)生有重要影響。

一直以來(lái)，棉花輪紋斑病菌鏈格孢人工接種十分困難，主要原因是其孢子萌發(fā)條件苛刻，難以侵染正常生長(zhǎng)的棉花葉片[10]。李莎在對(duì)棉花輪紋斑病研究中，主要采用涂菌+套袋保濕接種法，利用塑封袋保持棉葉較高的相對(duì)濕度，使棉株成功發(fā)病[11]。但套袋條件下，葉片所處環(huán)境通風(fēng)條件欠佳，所形成的葉斑不能排除其他霉菌所致；且涂菌葉片工作量大，傷葉不均勻，致使試驗(yàn)條件一致性較差。此外，套袋后的棉苗難以承受塑封袋，倒伏嚴(yán)重，生長(zhǎng)受影響較大。因此，有必要對(duì)棉花輪紋斑病的接種方法進(jìn)一步優(yōu)化，在有效接種的前提下，保障試驗(yàn)條件的一致性，同時(shí)減輕雜菌對(duì)接種的干擾，免除塑封袋對(duì)棉花正常生長(zhǎng)的影響，從而為棉花輪紋斑病的研究提供更好的接種方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的棉花品種有新陸早7號(hào) （XLZ 7）、新陸早 13 號(hào)（XLZ 13）、新陸早 33 號(hào)（XLZ 33）、中植棉 KV3（KV3）。

棉花輪紋斑病病原菌鏈格孢為本實(shí)驗(yàn)室從棉花病葉分離、鑒定和保存[11]。

培養(yǎng)鏈格孢的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）制備：馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，121℃濕熱滅菌30 min。

1.2 材料的培養(yǎng)

1.2.1棉苗培養(yǎng)。選取外觀一致籽粒飽滿的種子，先用75%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇表面消毒處理5 min，無(wú)菌水清洗后，用5%（體積分?jǐn)?shù)）的雙氧水表面消毒處理2 h，隨后用無(wú)菌水沖洗3遍。播種于盛有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石混合土（體積比2∶1）的營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽播種10粒種子。將營(yíng)養(yǎng)缽放置在晝夜溫度分別為28℃、22℃，光暗時(shí)間分別為16 h、8 h的條件下培養(yǎng)，適時(shí)澆水，保持相對(duì)含水量在70%～80%。

1.2.2孢子懸浮液的制備。在PDA培養(yǎng)基上，于26～28℃暗光條件下進(jìn)行鏈格孢產(chǎn)孢培養(yǎng)15 d后，用無(wú)菌刀片刮取菌絲體及孢子，放入盛有適量無(wú)菌水的三角瓶中，在180 r·min－1搖床上振蕩培養(yǎng)15～20 min，用4層無(wú)菌紗布過濾，獲得孢子懸浮液。通過顯微計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水將孢子懸浮液的孢子含量調(diào)整至1.2×104mL－1左右并用于接種[12]。

1.2.3接種方法。（1）涂菌＋套袋保濕接種法：待棉苗長(zhǎng)至2片真葉完全展開時(shí)，用新配制的孢子懸浮液接種真葉。具體方法是用寬1.5 cm左右滅過菌的毛刷，蘸取孢子懸浮液（1.2×104mL－1），在棉花葉片背面輕輕均勻涂菌2次[13]。每片葉接種約1 mL孢子懸浮液。接種后用塑封袋套住葉片，以保持濕度[11]。白天溫度控制在28～30℃，夜晚溫度控制在22～25℃。

（2）涂菌＋噴霧保濕接種法：待棉苗長(zhǎng)至2片真葉完全展開時(shí)，用新配制的孢子懸浮液接種真葉。具體方法是用寬1.5 cm左右滅過菌的毛刷，蘸取孢子懸浮液（1.2×104mL－1），在棉花葉片背面輕輕均勻涂菌2次[13]。每片葉的接種量約為1 mL孢子懸浮液。采用加濕器噴霧保濕，每天加水1次，可連續(xù)噴霧保濕至少12 h，將環(huán)境濕度一直控制在90%以上，持續(xù)保濕5 d[14-15]。白天溫度控制在28～30℃，夜晚溫度控制在22～25℃。

（3）噴菌＋噴霧保濕接種法：待棉苗長(zhǎng)至2片真葉完全展開時(shí)，用新配制的孢子懸浮液接種真葉。具體方法是將孢子懸浮液（1.2×104mL－1）用噴壺均勻噴灑在棉花第1、第2片真葉的正反面。加濕器噴霧保濕及溫度控制條件與上述涂菌＋噴霧保濕接種法相同。

上述3種接種方法每個(gè)處理均為12缽，每缽留苗5～6株，重復(fù)3次。

1.3 病害的調(diào)查和統(tǒng)計(jì)

1.3.1涂菌接種病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。棉苗接種后每天觀察病害的發(fā)生情況，分別在接種第3、6、9、12、15、20天調(diào)查發(fā)病情況，并按以下標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)病級(jí)別。參考Mehta的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[16]：0級(jí)/免疫：全葉無(wú)病/極小免疫白斑；1級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積5%以下；2級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積5%～25%（含）；3級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積25%～50%（含）；4級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積50%～75%（含）；5級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積75%以上，葉片干枯或脫落。

1.3.2噴菌接種病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。棉苗接種后每天觀察病害的發(fā)生情況，分別在接種第3、6、9、12、15、20天調(diào)查發(fā)病情況，并按以下標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)病級(jí)別。參考Mehta的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[16]，稍作修改：0級(jí)/免疫：全葉無(wú)??；1級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積1%以下；2級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積1%～5%（含）；3級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積5%～10%（含）；4級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積10%～20%（含）；5級(jí)：發(fā)病面積占全葉總面積20%以上。

1.3.3計(jì)算公式。涂菌接種和噴菌接種法的病情指數(shù)（ID）和發(fā)病率（rD）計(jì)算公式相同：ID=[∑（NDL，i×i）／N×imax（5）]×100；rD=NDL/N×100%。式中，i為棉葉病級(jí)，imax為最高病級(jí)，NDL，i為i級(jí)病葉數(shù)，N為調(diào)查的總?cè)~片數(shù)，NDL為發(fā)病總?cè)~數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方法的比較

2.1.1不同接種方法棉花輪紋斑病的發(fā)病情況比較。選取棉花品種新陸早13號(hào)，采用不同的輪紋斑病接種方法進(jìn)行接種，結(jié)果（圖1）表明，涂菌＋噴霧保濕接種法的發(fā)病率最高，為60%～70%，病情指數(shù)可超過30；噴菌＋噴霧保濕接種法發(fā)病率可達(dá)50%，病情指數(shù)可超過20；涂菌＋套袋保濕接種法與噴菌＋噴霧保濕接種法相比，發(fā)病率相近，病情指數(shù)略低。

圖1 不同接種方法棉花輪紋斑病發(fā)病情況的比較Fig.1Comparison of different inoculation methods on disease incidence of cotton Alternaria leaf spot

2.1.2不同接種方法發(fā)病時(shí)間的比較。涂菌＋噴霧保濕接種法與噴菌＋噴霧保濕接種法相比，涂菌＋噴霧保濕和涂菌＋套袋保濕接種后3 d即可觀察到病斑；而噴菌＋噴霧保濕接種法發(fā)病周期較長(zhǎng)，發(fā)病進(jìn)程緩慢，接種后6 d左右才能觀察到葉片輕微病狀，邊緣輕微黃化失綠，有小的病斑形成。

2.1.3不同接種方法病斑比較。觀察不同接種方法的葉片病斑，結(jié)果（圖2）顯示：涂菌＋噴霧保濕接種法與涂菌+套袋保濕接種法均可使葉片產(chǎn)生較大面積的黑色病斑，但病斑形狀不規(guī)則，且病斑一般發(fā)生在涂菌傷口周圍。噴菌＋噴霧保濕接種法由于未對(duì)棉花葉片造成損傷，模擬鏈格孢菌田間發(fā)病環(huán)境，溫度和濕度適宜，所以發(fā)病均勻，且與田間癥狀一致，病斑呈圓形或不規(guī)則輪紋狀，從葉邊緣開始發(fā)展，使葉片逐漸黃化、干枯，直至脫落。棉花葉片黃花脫落，極可能是由于病原菌鏈格孢產(chǎn)生的毒素，破壞了棉葉的細(xì)胞組織，導(dǎo)致棉葉過早衰老。

圖2 不同接種方法病斑比較Fig.2 Comparison of different inoculation methods on leaf spots

分離不同接種方法的病原菌結(jié)果 （圖3）表明，涂菌＋噴霧保濕接種法主要分離到的是鏈格孢菌，且雜菌較少，甚至沒有其他雜菌污染；噴菌＋噴霧保濕接種法也只分離到鏈格孢菌，沒有發(fā)現(xiàn)被其他雜菌污染的情況；而涂菌＋套袋保濕接種法不僅能分離到鏈格孢菌，還分離到其他雜菌。分析其原因可能是由于套袋后空氣不流通，有些病斑是由霉菌所引起。

2.2 2種接種方法鑒別不同棉花品種對(duì)輪紋斑病抗性的差異

圖3 各接種方法形成病斑中病原菌的再分離情況Fig.3 Pathogens re-isolation from lesions of different inoculation methods

繼續(xù)對(duì)涂菌＋噴霧保濕接種法與噴菌＋噴霧保濕接種法進(jìn)行比較，檢驗(yàn)不同棉花品種對(duì)輪紋斑病的抗性，結(jié)果表明，涂菌＋噴霧保濕接種法中，新陸早7號(hào)和新陸早13號(hào)的發(fā)病率基本在60%左右（圖4-a），病情指數(shù)最高可達(dá)35～40（圖4-b），遠(yuǎn)高于中植棉KV3和新陸早33號(hào)（圖4-a，b），表現(xiàn)為感??；噴菌＋噴霧保濕接種法中，新陸早7號(hào)和新陸早13號(hào)的發(fā)病率 （圖4-c）和病情指數(shù)（圖4-d）同樣也高于中植棉KV3和新陸早33號(hào)，表現(xiàn)為感病，說明2種接種方法皆能明顯區(qū)分棉花輪紋斑病感病品種新陸早7號(hào)、新陸早13號(hào)與抗病品種中植棉KV3、新陸早33號(hào)。但涂菌＋噴霧保濕接種法在接種初期各品種植株發(fā)病率和病情指數(shù)就已達(dá)到一定水平，發(fā)病趨勢(shì)較緩；而噴菌+噴霧保濕接種法各品種棉株的發(fā)病率和病情指數(shù)呈自然上漲趨勢(shì)，但發(fā)病周期較長(zhǎng)。

圖4 2種接種方法鑒別不同棉花品種對(duì)輪紋斑病抗性的差異Fig.4 Comparison of cotton varieties resistance to cotton Alternaria leaf spot identified by the two inoculation methods

觀察各品種植株發(fā)現(xiàn)，新陸早7號(hào)和新陸早13號(hào)發(fā)病嚴(yán)重，接種葉片發(fā)黃失綠，甚至干枯、脫落；而中植棉KV3和新陸早33號(hào)，植株病情較輕，接種葉片無(wú)明顯失綠現(xiàn)象，且病斑大小基本穩(wěn)定并不繼續(xù)發(fā)展。

3 討論與結(jié)論

棉花輪紋斑病可發(fā)生在棉花生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期，且環(huán)境條件對(duì)棉花的抗病性有較大的影響，再加上接種困難，目前尚沒有高效的抗病鑒定方法。有研究表明，黑暗處理有利于棉花輪紋斑病病原菌分生孢子的萌發(fā)，且其分生孢子萌發(fā)對(duì)溫濕度要求較高，在高溫高濕環(huán)境中較易萌發(fā)和侵染[11]。棉花葉片內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也能刺激分生孢子的萌發(fā)[17]，棉花葉片損傷后內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外滲更利于輪紋斑病的發(fā)生；鏈格孢容易侵染葉齡較大或者遭受低溫等生理傷害的棉花葉片[8]。綜合考慮這些因素以及前期經(jīng)驗(yàn)，本研究嘗試涂菌＋噴霧保濕接種法與噴菌＋噴霧保濕接種法，對(duì)棉株第1、第2片真葉進(jìn)行接種，用以替代涂菌＋套袋保濕接種法，進(jìn)一步優(yōu)化棉花輪紋斑病的接種方法。

結(jié)果表明，噴菌+噴霧保濕接種法較所試的另外2種方法發(fā)病更加均勻和穩(wěn)定。這種方法不傷葉，避免了因?yàn)閭~不均勻造成的發(fā)病不均勻而影響試驗(yàn)結(jié)果的一致性。此外，噴菌＋噴霧保濕接種法既可保證適宜病原菌生長(zhǎng)的濕度，又可避免涂菌＋套袋保濕接種法中因空氣不流通造成的葉片腐爛對(duì)病斑調(diào)查造成的干擾。且不套袋后，棉苗不用承受塑封袋質(zhì)量，能夠正常直立生長(zhǎng)。

本研究建立的鏈格孢噴菌＋噴霧保濕接種法接近田間自然發(fā)病條件，避免了雜菌污染，能夠有效區(qū)分棉花的抗感品種，是1種更適合棉花鏈格孢抗性研究的接種方法，可為棉花輪紋斑病的研究提供技術(shù)支持。