基于重測序開發(fā)的InDel標記定位陸地棉矮化突變體

季高翔，何守樸，潘兆娥，龔文芳，賈銀華，王立如，王朋朋，耿曉麗，杜雄明

（中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

植物矮化是重要的農(nóng)藝性狀，矮化品種的選育可有效改善種植密度、提高抗倒伏能力、便于機械化管理，對于減少勞動強度、提高肥料利用率和提高產(chǎn)量具有重要意義。棉花具有無限生長的習性，培育矮化品種對于棉花尤為重要。目前棉花生產(chǎn)仍然需要人工打頂，從而控制棉花的株高，大面積植棉區(qū)如新疆主要利用噴施縮節(jié)胺來代替人工打頂，但是縮節(jié)胺的使用嚴重污染自然環(huán)境。因此，培育矮化品種不僅可以給生產(chǎn)帶來很多的便利，而且可以減少對環(huán)境的污染。

分子標記是構(gòu)建遺傳圖譜實現(xiàn)基因定位和分子標記輔助選擇育種的強有力工具，20世紀70年代Grodzicker等[1]首先創(chuàng)立了基于酶切技術(shù)的RFLP（限制性片段長度多態(tài)性，Restriction fragment length polymorphism），到后來基于PCR（聚合酶鏈式反應，Polymerase chain reaction）技術(shù)的 SSR[2]（簡單重復序列，Simple sequence repeat）、AFLP[3]（擴增長度多態(tài)性，Amplified fragment length polymorphism），再到后來的InDel（插入 /缺失，Insertion-deletion）、SNP[4]（單核苷酸多態(tài)性，Single nucleotide polymorphism），分子標記技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了第三代。隨著測序技術(shù)的迅速發(fā)展，利用重測序的技術(shù)開發(fā)分子標記在水稻[5]、黃瓜[6]、棉花[7]等上均有應用。

本課題組在棉花種間雜交后代中發(fā)現(xiàn)1株自然矮化突變體AS98。張超等[8]研究表明極端矮化材料AS98的矮化性狀是受1對不完全顯性基因控制的質(zhì)量性狀，隨后又利用AFLP和SSR標記對矮化基因進行定位分析，結(jié)果找到了與目標基因距離較近的2個分子標記，1個SSR標記（距離目標基因為4.9 cM）和1個AFLP標記（距離目標基因為9.7 cM）。隨著棉花基因組測序的完成[9-10]，基因組的信息為前人初定位的結(jié)果提供了驗證依據(jù)，再加上分子標記技術(shù)的發(fā)展，也為實現(xiàn)基因定位提供了很大的幫助。本研究利用基因組重測序的數(shù)據(jù)開發(fā)覆蓋全基因組的InDel標記，并利用新開發(fā)的InDel標記實現(xiàn)矮化基因的重新定位。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與群體構(gòu)建

本試驗所用親本AS98和LHF10來自中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所的種質(zhì)資源，其中AS98由陸地棉自然突變體多代自交純化而來，性狀已純合穩(wěn)定。LHF10為陸地棉正常高度材料。2016年4月在中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所實驗基地（河南省安陽縣）種植AS98半矮株和LHF10，利用AS98分離出來的半矮株作為父本與LHF10（母本）進行雜交，收獲雜交種子。2017年4月在安陽種植AS98半矮株以及收獲的雜交種子，分別作為2個群體，一個（群體1）用作定位，另一個（群體2）用作分離比的調(diào)查（表1）。

表1 2個分離群體信息Table 1 The information of the two segregation populations

1.2 試驗方法

1.2.1性狀調(diào)查與采樣。2017年7月，田間植株已基本實現(xiàn)高矮分化，判斷標準為：與親本AS98性狀相同的，即出土10～15 cm，無側(cè)枝，且節(jié)間極度縮短的為極矮株；與LHF10性狀相同的，即出土50 cm以上，節(jié)間正常，株型不緊湊為高株；介于2個親本之間的，即出土15～50 cm，節(jié)間縮短，株型緊湊為半矮（圖1）。其中群體1，親本各選10株掛牌并對F2的每個單株掛牌編號，每個掛牌的植株各取2～3片大小適中、無病蟲害的嫩葉作為提取DNA的樣品材料，并記錄每一株的高矮類型；群體2只調(diào)查植株性狀。并用SAS軟件對分離群體的高矮株數(shù)進行卡方檢驗。

圖1 2個親本及其雜交種的形態(tài)學特征Fig.1 The morphology of two parents and their hybrid

1.2.2基因組DNA的提取。采用宋國立等[11]改良的CTAB法提取DNA，并用1%（質(zhì)量分數(shù)）瓊脂糖對核酸質(zhì)量進行檢測。

1.2.3InDel標記的開發(fā)及多態(tài)性篩選。分別取極端矮化株AS98和正常高株LHF10各3株的DNA混樣測序，AS98和LHF10平均測序深度分別為11.85×、13.32×，覆蓋度均在97%以上，測序質(zhì)量正常?；跍y序結(jié)果，進行InDel標記的開發(fā)，采用GATK3.3軟件的Unified Genotyper模塊進行InDel的檢測，使用Variant Filtration進行過濾，過濾參數(shù)為filterExpression"QD＜4.0||FS＞200.0"。隨后對2個親本中的InDel進行基因分型，去掉在2個親本中的同一個位置上發(fā)生相同插入或者缺失的InDel位點作為差異InDel。根據(jù)親本的InDel信息，提取InDel上下游各100 bp（base pairs）的序列，并根據(jù)上下游序列設計引物，引物的TM值在50～60℃，長度為18～22 bp，產(chǎn)物為80～288 bp。根據(jù)張超等[8]初定位的結(jié)果，找出與目標基因在一個連鎖群上的所有SSR標記，分別用AS98和LHF10進行多態(tài)性檢測，隨后挑選該區(qū)段內(nèi)新開發(fā)的所有InDel標記，同樣用2個親本對多態(tài)性進行篩選，篩選出多態(tài)性引物之后對F2群體的223單株進行基因分型，結(jié)合其表型，實現(xiàn)矮化基因的定位。

1.2.4PCR反應與凝膠電泳。SSR引物序列來自CottonDB（http://www.cottondb.org/）數(shù)據(jù)庫，InDel引物序列由自己開發(fā)，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應體系為10 μL，包括10×buffer（含 20 mol·L－1Mg2＋）1.0 μL， dNTP（10 mol·L－1）0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（2.5 U·μL－1）0.1 μL，50 mg·L－1的模板 DNA 1.5 μL， 前后引物（5 μmol·L－1）各 0.75 μL，雙蒸水補至 10 μL。反應程序為：94℃預變性3 min；然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃再延伸5 min；4℃保存。隨后用8%（質(zhì)量分數(shù)）的聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后拍照并記錄帶型。

1.2.5遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。對群體帶型進行統(tǒng)計，與AS98帶型相同的記為1，與LHF10相同的記為2，同時具有2個親本帶型的記為3，缺失記為“-”，隨后利用Joinmap4.0構(gòu)建遺傳連鎖圖，其中對數(shù)優(yōu)勢比 （Logarithm of the old some，LOD） 設為3.0，選用Kosambi函數(shù)進行遺傳距離（cM）的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀調(diào)查與分離比的卡方檢驗

根據(jù)方法中所述的高矮判斷標準，統(tǒng)計得到群體1的極矮株、半矮株、高株，3種表型的分離比為42∶102∶79，群體2有高株和半矮株2種表型，它們的比例為648∶602，經(jīng)卡方適合性檢驗，群體 1 不符合1∶2∶1（P＜0.05）的分離比，但矮株和半矮株之和與高株呈2∶1（P＞0.05）的分離比；群體2符合1∶1（P＞0.05）的分離比。這說明矮稈性狀為顯性，高株為隱性，但后代的純合顯性棉株可能因長勢過弱而致死，其機理還有待進一步研究。

2.2 InDel標記的篩選

對張超等[8]初定位與目標性狀連鎖的SSR標記在AS98（親本矮株）以及LHF10（親本高株）中進行多態(tài)性篩選，發(fā)現(xiàn)其中一個SSR引物NAU5204在親本間表現(xiàn)多態(tài)性，利用CottonFGD（https://cottonfgd.org/）查閱該標記的信息，結(jié)果顯示該標記在D12染色體上（起始位置：55 255 848 bp；結(jié)束位置：55 256 113 bp；覆蓋度：100%； 同一性100%）。因此，本試驗以NAU5204標記開始的物理位置（D12，55 255 848 bp）為坐標在新開發(fā)的InDel數(shù)據(jù)庫中距離NAU5204前后各1 Mb（54～56 Mb之間）挑選114對InDel標記，經(jīng)親本篩選共有20對表現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性頻率為17.5%。

2.3 InDel標記分析與遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

圖2 F2群體InDel和SSR標記部分檢測結(jié)果Fig.2 Partial detection results of InDel and SSR markers in F2

圖3 AS98遺傳連鎖圖以及物理圖譜Fig.3 Linkage map and physical map ofAS98

用上述具有多態(tài)性的20對引物，加上NAU5204，總共21對引物，對 F2中223個單株進行檢測（圖2）。利用Joinmap4.0進行遺傳連鎖圖譜構(gòu)建，在LOD≥3的情況下，共有14個標記在一個連鎖群上（圖3）。與目標基因AS98連鎖的標記群體分離情況（表2）顯示，除了InDel-60、InDel-83、InDel-97、InDel-101偏分離比較嚴重外，其他標記在群體中均正常分離。連鎖圖譜顯示矮化性狀標記位于InDel-50和InDel-83之間，其中距離InDel-50的遺傳距離為6.9 cM，距離InDel-83的遺傳距離為23.3 cM。與目標性狀連鎖的InDel以及SSR標記相關(guān)信息見表3。

3 討論

棉花的矮化突變體資源有限，自1918年Harland[12]在海島棉中發(fā)現(xiàn)1個“矮皺突變體”（Crinkled dwarf）以來，只有10多個棉花矮化突變體被發(fā)現(xiàn)及鑒定。Hutchinson等[13]在陸地棉中也發(fā)現(xiàn)了“矮皺突變體”，McMichael等[14]在陸地棉Acala中發(fā)現(xiàn)1個 “矮皺與紅葉”突變體。Quisenberry等[15]鑒定了1個具有數(shù)量性狀遺傳特點，且植株矮小，早熟，纖維短、細、強度差的突變體Lubbock dwarf。而Abzalov等[16]發(fā)現(xiàn)了純合顯性基因型致死的矮稈系L-69。戴日春等[17]在陸地棉品種協(xié)作二號中，發(fā)現(xiàn)1株叢生矮化突變體。何鑒星等[18]在陸地棉科遺2號（Gossypium hirsutumL.）×中棉（Gossypium arboreumL.）的種間雜交后代中分離出1株矮稈小葉突變體，育成了“矮早1號”。陳旭升等[19]在陸地棉C119-2分離群體中發(fā)現(xiàn)株高只有10.5 cm的突變體 “超矮1號”。劉愛玉等[20]報道“陸矮1號”的矮化特性主要為細胞核數(shù)量性狀遺傳，可能還存在部分細胞質(zhì)效應。雖然棉花矮化突變體形態(tài)遺傳研究已有初步進展，但對矮稈基因定位的分子研究少見報道。景超等[21]對1個陸地棉隱性超矮稈突變體基因進行了初步定位。Liu等[22]對陸地棉組合CRI12×J8891的重組自交系株高QTL分析表明，其株高受主基因和微效基因共同作用。Yang等[23]在棉花中鑒定出來1個油菜素內(nèi)酯代謝途徑上的基因PAG1，可以調(diào)節(jié)纖維發(fā)育。本研究對棉花矮化突變體的基因定位研究有助于進一步的精細定位及分子標記輔助選擇育種。

表2 14對標記在F2群體（223株）中的分離情況Table 2 The separation of 14 pairs of markers in the F2population（containing 223 individuals）

表3 與AS98連鎖的InDel以及SSR引物序列Table 3 InDel and SSR primer sequences of linkage mapping withAS98

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

InDel標記具有準確性高、多態(tài)性豐富、分布廣泛等特點，而且利用InDel標記可基于PCR擴增技術(shù)對群體進行分型。相對于SNP復雜的分型系統(tǒng)，InDel標記就顯得簡單快捷，利用普通的聚丙烯酰胺凝膠電泳就可以實現(xiàn)。除此之外，InDel標記的擴增產(chǎn)物帶型清晰，易于記錄，而且對DNA的質(zhì)量要求不高，樣品量要求也比較小[24]，而有些SSR標記的擴增結(jié)果會受到DNA質(zhì)量的影響，從而影響基因分型結(jié)果[25]。InDel標記也有其局限性，對于未知基因組信息的物種來說，InDel標記的開發(fā)只能根據(jù)已知基因的序列，這樣開發(fā)的InDel數(shù)量有限，且覆蓋面窄。但是隨著很多物種基因組計劃的完成，結(jié)合基因組信息大量開發(fā)InDel標記得以實現(xiàn)。

近年來棉花基因組測序[9-10]已完成，基于基因組信息的測序技術(shù)也得到了迅猛發(fā)展，利用測序技術(shù)開發(fā)分子標記在黃瓜[6]和棉花[7]上都有實現(xiàn)。本試驗利用重測序技術(shù)在基因組水平上檢測極端矮化材料AS98和正常高株LHF10之間的序列差異，并在2個材料插入缺失位點開發(fā)設計InDel標記。為了進一步定位控制棉花矮化突變體AS98的基因，本試驗在前人[8]的基礎上利用新開發(fā)的部分標記對AS98中控制矮化性狀的基因進行了重新定位。相較于前人的研究，重新定位的結(jié)果把該基因定位到具體的染色體上，即D12染色體上，位于InDel50和InDel83標記之間，這2個標記的物理間距僅有45 kb，但是遺傳距離卻有30.2 cM，而且遺傳圖譜與根據(jù)基因組信息[10]構(gòu)建的物理圖共線性不理想。我們猜想有可能是AS98極端矮化材料特殊，在該區(qū)段內(nèi)有染色體結(jié)構(gòu)上的變異，或者會有其他不明的原因，有待進一步研究。

在我們選擇的區(qū)間內(nèi)篩選的InDel標記，多態(tài)性頻率僅有17.5%，這說明本試驗開發(fā)的InDel標記存在一定的假陽性。究其原因可能是研究對象是多倍體的陸地棉，在檢測插入和缺失突變的時候會受到亞組之間差異的影響[26]?？傊?，利用重測序開發(fā)覆蓋全基因組的InDel標記，并利用這些標記實現(xiàn)基因的定位是可以實現(xiàn)的。本試驗最終利用新開發(fā)的InDel標記對AS98矮化性狀基因?qū)崿F(xiàn)了重新定位，重新定位的結(jié)果可以為進一步的精細定位奠定基礎。