重組纖溶酶抑制劑Textilinin-1蛋白含量測(cè)定方法的對(duì)比研究

蘭海英，康樂(lè)，陳宏超，李娜，徐梅

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重組纖溶酶抑制劑Textilinin-1蛋白含量測(cè)定方法的對(duì)比研究

蘭海英，康樂(lè)，陳宏超，李娜，徐梅

110171 沈陽(yáng)，遼寧遠(yuǎn)大諾康生物制藥有限公司

Textilinin-1 是從擬眼鏡蛇中提取的 Kunitz 型蛋白酶抑制劑，具有纖溶酶抑制活性，可抑制基于纖溶酶被激活導(dǎo)致纖維蛋白溶解所導(dǎo)致的出血，因此具有開(kāi)發(fā)為止血藥的潛力，可以作為外科手術(shù)中抑肽酶的替代藥物[1]。目前已有含 Textilinin-1 基因的重組畢赤酵母菌種，能高效表達(dá)目的蛋白[2]。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定是重組蛋白類藥物質(zhì)量控制中的重要指標(biāo)之一，準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)含量測(cè)定對(duì)產(chǎn)品的分裝、比活性計(jì)算、殘留雜質(zhì)的限量控制以及其他理化特性測(cè)定均具有重要意義[3]。在研究過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)不同方法測(cè)定的 Textilinin-1 蛋白含量結(jié)果差異很大，表明結(jié)果的準(zhǔn)確與使用的方法有相關(guān)性。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)的準(zhǔn)確性以及未來(lái)生產(chǎn)中的工作效率，我們比較分析了凱氏定氮法、BCA 法和紫外吸收法在 Textilinin-1 蛋白含量測(cè)定中的精確性和準(zhǔn)確性，結(jié)果表明紫外吸收法是更適合于測(cè)定 Textilinin-1 蛋白含量的質(zhì)量控制方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品 中試生產(chǎn)的 3 個(gè)批次的 Textilinin-1 蛋白原液 20160804、20160810 和 20160819；對(duì)照品牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，批號(hào) WXBC3531V。

1.1.2 主要試劑及儀器 BCA 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）公司；鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液購(gòu)自沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠；催化劑片購(gòu)自丹麥福斯公司；濃硫酸、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；KjeltecTM8400 凱氏定氮儀和 TecatorTMDigestor 消化爐購(gòu)自丹麥福斯公司；Biotek Epoch2 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司；UV5Bio 紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)梅特勒公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品 50 mmol/L 的 Tris-HCl（pH 7.5）為空白對(duì)照；供試品為 3 批次 Textilinin-1 蛋白原液；BSA 用空白對(duì)照液溶解配成 40 mg/ml 的溶液作為對(duì)照品。

1.2.2 凱氏定氮法 按照 KjeltecTM8400 自動(dòng)定氮儀使用操作規(guī)程對(duì)樣品定氮。上述樣品分別準(zhǔn)確量取 2 ml 加入消化管，同時(shí)加入一片催化劑片及 10 ml 濃硫酸，置消化爐上，采取逐步升高溫度的方法 250 ℃ 30 min，330 ℃50 min，420 ℃ 2 h 進(jìn)行消化后冷卻至室溫。將樣品置于凱氏定氮儀上定氮，供試品和對(duì)照品測(cè)定結(jié)果分別除以各自蛋白的氮含量系數(shù) 15.90%（Textilinin-1）和 16.45%（BSA 蛋白），即得到供試品和對(duì)照品的蛋白質(zhì)含量。供試品和對(duì)照品都平行測(cè)定 3 次。

1.2.3 BCA 法 按照 BCA 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。562 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下，采用酶標(biāo)板法在酶標(biāo)儀中進(jìn)行測(cè)定，3 批次供試品的檢測(cè)值應(yīng)該落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，最終的稀釋倍數(shù)為 20160804 稀釋 400 倍，20160810 稀釋 240 倍，20160819 稀釋 504 倍，對(duì)照品稀釋 100 倍，所有檢測(cè)樣品均進(jìn)行 3 個(gè)平行稀釋。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到稀釋樣品的蛋白濃度，再乘以稀釋倍數(shù)得到樣品濃度。

1.2.4 紫外吸收法 將 3 批次供試品 20160804 稀釋 100 倍，20160810 稀釋 60 倍，20160819 稀釋 126 倍，對(duì)照品稀釋 40 倍，所有檢測(cè)樣品均進(jìn)行 3 個(gè)平行稀釋。用 1.0 cm 光程的石英比色皿進(jìn)行檢測(cè)。在全波長(zhǎng)掃描模式下進(jìn)行掃描，得到 Textilinin-1 蛋白和 BSA 蛋白的最大吸收波長(zhǎng)（277 nm 和 278 nm）。在各自的最大吸收波長(zhǎng)下，確保吸光值（）在 0.3 ~ 0.7 之間。根據(jù)朗伯-比爾定律C =（/ ε）× 10 求得蛋白濃度。ε 為蛋白的百分比消光系數(shù)。Textilinin-1 蛋白的 ε 經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期工作確證為 7.3，BSA 蛋白的 ε 為 6.6[4]。

2 結(jié)果

2.1 BCA 法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以試劑盒中的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以其各濃度在 562 nm 處吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 1）。得到回歸方程 y = 0.952x + 0.121，線性相關(guān)系數(shù)2= 0.997，表明線性關(guān)系良好。

圖 1 BCA 法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 3 種檢測(cè)方法對(duì)蛋白含量測(cè)定結(jié)果比較

3 種檢測(cè)方法對(duì)蛋白含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 1。

由表 1 結(jié)果可以看出，3 個(gè)平行檢測(cè)值的變異系數(shù)均 < 5%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程誤差小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。對(duì)照品 BSA 溶液的 3 種檢測(cè)方法的蛋白含量結(jié)果接近一致，而3 批原液的檢測(cè)結(jié)果，凱氏定氮法與紫外吸收法檢測(cè)結(jié)果接近，BCA 法則比其他兩種方法檢測(cè)值高出 50% 以上，詳細(xì)的比較結(jié)果見(jiàn)表 2。

對(duì)供試品 Textilinin-1 蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品 BSA 蛋白的還原性氨基酸數(shù)量進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)表 3。Textilinin-1 蛋白中含有的還原性氨基酸比例為 15.25%，BSA 蛋白的比例為 9.78%。

3 討論

曲耀成和姚雪[5]將蛋白含量測(cè)定方法系統(tǒng)地分成 3 類：標(biāo)準(zhǔn)定量法（包括凱氏定氮法和氨基酸分析法）、比色分析法（包括 Lowry 法、雙縮脲法、BCA 法和 Bradford 法）以及紫外吸收法。本實(shí)驗(yàn)采取的 3 種檢測(cè)分屬于此 3 類方法。

凱氏定氮法是一種通過(guò)含氮量分析進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定的經(jīng)典方法，其優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，被國(guó)際國(guó)內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。其缺點(diǎn)是操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，試劑消耗量大。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行的凱氏定氮測(cè)定結(jié)果可以作為標(biāo)準(zhǔn)定量，以尋找更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法。

表 1 3 種蛋白含量測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果

表 2 3 種檢測(cè)方法的蛋白含量差異率的比較

表 3 Textilinin-1 蛋白和 BSA 蛋白中還原性氨基酸數(shù)量的比較

BCA 法反應(yīng)原理為蛋白質(zhì)將二價(jià)銅離子還原成亞銅離子，后者在堿性條件下與 BCA 絡(luò)合生成紫紅色絡(luò)合物。此化合物在 562 nm 處有最大吸收波峰，反應(yīng)物的顏色和蛋白濃度在一定范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。BCA 法反應(yīng)原理包括兩個(gè)方面：一是蛋白中的肽鍵將 Cu2+還原為 Cu+，并且在60 ℃條件下，肽鍵將 Cu2+還原為 Cu+的作用比在室溫更大；二是蛋白中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）等還原性氨基酸將 Cu2+還原為 Cu+，這一反應(yīng)與溫度關(guān)系不大[6]。本研究中，3 批原液的 BCA 法檢測(cè)值均高于凱氏定氮法檢測(cè)值的 50% 以上，說(shuō)明 BCA 法中使用的標(biāo)準(zhǔn)品 BSA 蛋白不能準(zhǔn)確地定量供試品蛋白，其原因是兩種蛋白之間的差異性較大，這些差異可能與蛋白質(zhì)的氨基酸序列、等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及能夠引起蛋白顏色反應(yīng)產(chǎn)生顯著變化的側(cè)鏈或輔基等有關(guān)[7]。表 3 中供試品蛋白含有的還原性氨基酸比例為 15.25%，而標(biāo)準(zhǔn)品 BSA 蛋白的比例僅為 9.78%。因此， BCA 法檢測(cè)供試品蛋白含量偏高的主要原因可能是因?yàn)楣┰嚻分羞€原性氨基酸含量比標(biāo)準(zhǔn)品 BSA 中還原性氨基酸含量高 50% 以上，從而增加了 Cu2+還原為 Cu+的數(shù)量，因此 Cu+與 BCA 絡(luò)合生成紫紅色絡(luò)合物的產(chǎn)物就增加了，相應(yīng)的檢測(cè)值就高。

比色分析法中的其他方法的蛋白含量測(cè)定原理和 BCA 法相似，因此，通過(guò)BCA 法實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到如下提示：在采用比色分析法之前，可以先對(duì)待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的氨基酸序列進(jìn)行比較，如果待測(cè)樣品的還原性氨基酸的含量與標(biāo)準(zhǔn)品相差較大時(shí)，就不適宜采用比色分析法進(jìn)行測(cè)定。如果想要采用比色分析法定量，只有采用與待測(cè)樣品相同的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，才能有效避免實(shí)驗(yàn)誤差。

紫外吸收法的原理是由于色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此賦予了蛋白質(zhì)在 280 nm 處的紫外吸收特性。根據(jù)朗伯-比爾定律，在已知光程和消光系數(shù)的前提下，通過(guò)測(cè)定蛋白樣品在波長(zhǎng) 280 nm 的吸收值，即可獲得蛋白含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用紫外吸收法與凱氏定氮法測(cè)定供試品蛋白含量差異小于 5%，其結(jié)果接近準(zhǔn)確值。同時(shí)，與其他方法相比較，紫外吸收法還具有操作簡(jiǎn)單、快速、成本低、無(wú)污染的優(yōu)勢(shì)，并且測(cè)定后樣品還可以回收使用。本方法的核心問(wèn)題就是消光系數(shù)的確定，一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)基因重組技術(shù)獲得的蛋白質(zhì)藥物，其序列信息已知，可以通過(guò) Edelhoch 公式即 ε280=（5500 × nTrp）+（1490 × nTyr）+（125 × n S-S）計(jì)算蛋白的理論摩爾消光系數(shù)[8]。同時(shí)，在一般情況下獲得的重組蛋白的純度較高，通過(guò)凱氏定氮法準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)量，通過(guò)朗伯-比爾定律計(jì)算得到實(shí)測(cè)消光系數(shù)，并與理論消光系數(shù)對(duì)比，可以進(jìn)一步確證消光系數(shù)，這樣就能保證紫外吸收法測(cè)定蛋白含量的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)的供試品蛋白為含有 59 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，根據(jù)其 Trp、Tyr 及形成二硫鍵的數(shù)量，得到的理論摩爾消光系數(shù)為 4845，再除以蛋白分子量，得到理論百分比消光系數(shù)為 7.2。凱氏定氮法定量的供試品蛋白溶液測(cè)定 277 nm 下的紫外吸收值，通過(guò)公式計(jì)算得到實(shí)測(cè)的百分比消光系數(shù)為 7.3，與理論值相差為 1.4%，考慮到蛋白質(zhì)在自然狀態(tài)下的空間結(jié)構(gòu)也許會(huì)對(duì)消光系數(shù)產(chǎn)生影響，因此采用實(shí)測(cè)百分比消光系數(shù)值 7.3。不同的蛋白可能會(huì)存在理論值與實(shí)測(cè)值差異較大的情況，因此，在對(duì)消光系數(shù)賦值時(shí)，都需要進(jìn)行確證，以保證后續(xù)工作的準(zhǔn)確性。目前，已有多種重組蛋白和抗體采用紫外吸收法進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定[9-11]。

通過(guò)對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行比較分析，紫外吸收法具有準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)勢(shì)，因此確定紫外吸收法用于重組纖溶酶抑制劑 Textilinin-1 的蛋白含量測(cè)定。

通過(guò)對(duì) 3 類蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法的研究進(jìn)行如下總結(jié)：對(duì)于還未獲得蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，可以先采用標(biāo)準(zhǔn)定量法（凱氏定氮法或氨基酸分析法）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)定及消光系數(shù)的測(cè)定，并與理論消光系數(shù)對(duì)比確證。當(dāng)?shù)玫綐?biāo)準(zhǔn)蛋白后，蛋白含量的測(cè)定可以采用比色分析法；當(dāng)確證消光系數(shù)后，可以采用紫外吸收法。在實(shí)際工作中，對(duì)于一個(gè)全新的蛋白藥物，在選擇和確定檢測(cè)方法時(shí)，尤其是涉及建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，都需要根據(jù)目標(biāo)蛋白的屬性選擇不同原理的方法、不同廠家的試劑進(jìn)行系統(tǒng)分析和對(duì)比研究，最終確定合適的測(cè)定方法，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

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徐梅，Email：xumei@nkbp.com

2018-05-31

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.015