大鼠尾腱細(xì)胞外基質(zhì)制備方法及其用于肌腱損傷修復(fù)的前期研究

張凱紅，劉雪劍，孫百川，黃紹代，魯長風(fēng)，曲鵬瑋，韓運(yùn)寧，余文，孫遜，許文靜，汪愛媛，王玉，盧世璧，彭江，亓建洪

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大鼠尾腱細(xì)胞外基質(zhì)制備方法及其用于肌腱損傷修復(fù)的前期研究

張凱紅，劉雪劍，孫百川，黃紹代，魯長風(fēng)，曲鵬瑋，韓運(yùn)寧，余文，孫遜，許文靜，汪愛媛，王玉，盧世璧，彭江，亓建洪

271016 泰安，泰山醫(yī)學(xué)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究所（張凱紅、曲鵬瑋、韓運(yùn)寧、亓建洪）；100853 北京，中國人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所（張凱紅、劉雪劍、孫百川、黃紹代、魯長風(fēng)、余文、孫遜、許文靜、汪愛媛、王玉、盧世璧、彭江）

探究大鼠尾腱細(xì)胞外基質(zhì)制備方法及其復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建微組織，為組織工程法修復(fù)肌腱損傷所需生物材料提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

取 20 只 150 ~ 200 g SD 大鼠鼠尾作為實(shí)驗(yàn)材料，分別抽取出大鼠尾腱，經(jīng) PBS 徹底清洗后反復(fù)凍融 3 次，然后經(jīng)過 1% SDS 于室溫下處理 24 h，并用大量 PBS 清洗 1 周除去細(xì)胞殘?jiān)詈?0Co 消毒備用。對制備的大鼠尾腱細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行病理學(xué)染色，觀察細(xì)胞殘留情況。同時(shí)，檢測該來源的生物源性材料殘留 α-Gal 含量。此外，觀察制備的大鼠尾腱細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)，用 CCK-8 試劑盒檢測該生物材料的細(xì)胞毒性。

大體觀察可見，經(jīng)脫細(xì)胞處理過的尾腱體積增大，呈乳白色勻漿狀。HE 以及 DAPI 染色結(jié)果顯示，經(jīng)脫細(xì)胞處理后的尾腱細(xì)胞核大量減少，細(xì)胞數(shù)量顯著降低，每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)細(xì)胞殘余量不大于 5 個(gè)。脫細(xì)胞尾腱殘留 α-Gal 含量與正常尾腱相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，脫細(xì)胞尾腱殘留 DNA 極少。復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 7 d 相比培養(yǎng)1 d 活細(xì)胞數(shù)量明顯增多。CCK-8 毒性測試結(jié)果顯示這種脫細(xì)胞大鼠尾腱的生物相容性較好，沒有細(xì)胞毒性。

經(jīng)過脫細(xì)胞方法制備的大鼠尾腱細(xì)胞外基質(zhì)可有效除去細(xì)胞成分，并且與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞有較好的生物相容性，可作為一種生物材料用于肌腱損傷修復(fù)。

細(xì)胞外基質(zhì)； 肌腱修復(fù)； 大鼠尾腱

肌腱是維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定以及正常運(yùn)動的重要結(jié)締組織，由于肌腱組織細(xì)胞分布和營養(yǎng)血供較少，一旦損傷，其自我修復(fù)能力較差[1]。此外，肌腱的損傷還會導(dǎo)致一系列的并發(fā)癥，諸如關(guān)節(jié)不穩(wěn)、軟骨損傷、骨性關(guān)節(jié)炎等，嚴(yán)重時(shí)甚至影響關(guān)節(jié)的正常功能。每年在全球范圍內(nèi)有超過 3000 萬肌腱和韌帶損傷病例發(fā)生[2]，其中大多數(shù)與體育相關(guān)。然而，用目前的治療手段很難使損傷的肌腱完全恢復(fù)到傷前的狀態(tài)。因此，如何提高損傷肌腱的愈合效果以及最大限度恢復(fù)其正常功能是目前醫(yī)學(xué)面臨的一項(xiàng)重大難題。

近些年來，組織工程技術(shù)逐漸運(yùn)用到肌腱修復(fù)的領(lǐng)域，其中最關(guān)鍵的部分是選擇合適的支架。理想的組織工程支架應(yīng)該具備兩點(diǎn)特性[3]：①與宿主產(chǎn)生良好的生物相容性，給種子細(xì)胞的生長分化提供一個(gè)合適的環(huán)境；②具備一定的生物力學(xué)特性。動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究顯示，脫細(xì)胞肌腱能夠降低組織的免疫源性，使其與宿主以及種子細(xì)胞產(chǎn)生良好的生物相容性，用其修復(fù)肌腱損傷能在一定程度上恢復(fù)肌腱正常功能[4]。此外，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）能為種子細(xì)胞提供模擬正常機(jī)體的生長微環(huán)境，對維持干細(xì)胞特性有重要作用[5]。本研究采用脫細(xì)胞方法制備大鼠尾腱細(xì)胞外基質(zhì)，探究復(fù)合大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于肌腱損傷修復(fù)的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑、儀器

150 ~ 200 g SD 大鼠 20 只（雌雄不拒），由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。十二烷基硫酸鈉（SDS）購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；CCK-8 試劑盒購自日本 Dojindo 公司；α-Gal 試劑盒購自北京三藥科技開發(fā)公司；DMEM 培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清、膠原酶購自美國 Corning 公司；DAPI 購自美國 Vector 公司。Epoch Take3 微量孔板分光光度計(jì)為美國 Biotek 公司產(chǎn)品；微量注射器為浙江三愛儀器廠產(chǎn)品；冰凍切片機(jī)和SP8 激光共聚焦顯微鏡為德國 Leica 公司產(chǎn)品；DP70 熒光顯微鏡和 IX70 倒置相差顯微鏡均為日本 Olympus 產(chǎn)品；YT-CJ-2NB 超凈工作臺購自北京亞泰公司；低速臺式離心機(jī)購自北京白洋公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脫細(xì)胞尾腱制備 取 20 只 SD 大鼠鼠尾，將鼠尾按關(guān)節(jié)節(jié)段分離，充分抽取尾腱于盛有 PBS 的培養(yǎng)皿中。PBS 清洗后，置于雙氧水中浸泡過夜消毒。然后于–80 ℃深低溫冰箱冷凍 10 min，37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)處理 10 min，反復(fù)5 次。無菌 PBS 充分漂洗后，在無菌環(huán)境置于37 ℃搖床 1% SDS 振蕩 24 h，PBS 漂洗 1 周，每次 3 h，即可獲得脫細(xì)胞大鼠尾腱，最后60Co 消毒備用。

1.2.2 大鼠脫細(xì)胞尾腱大體以及組織學(xué)觀察 大體觀察脫細(xì)胞尾腱的形態(tài)、質(zhì)地、顏色等，對脫細(xì)胞組織進(jìn)行 HE、DAPI 染色，觀察脫細(xì)胞的效果。

1.2.3 大鼠脫細(xì)胞尾腱殘留 α-Gal 含量檢測 將濃縮的洗滌液用蒸餾水或純化水 20 倍稀釋，分別在相應(yīng)孔中加入抗體I反應(yīng)后的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品上清液各 100 μl。用封板膜封板后，置于 37 ℃溫箱中 60 min。小心揭掉封板膜，用移液槍吸干孔中液體，再每孔注入洗液 200 μl，浸泡 30 s，棄去孔板中洗液，洗滌 5 遍，盡量扣干。然后，在每孔中加酶標(biāo)試劑 100 μl。封板膜封板，置于 37 ℃溫箱中 30 min，再次沖洗孔板 5 遍。緊接著將 A 液和 B 液等體積混合均勻，每孔加入混合好的顯色液 100 μl，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫箱避光 30 min。最后取出酶標(biāo)板，迅速在每孔加終止液 50 μl，輕輕振蕩混勻，立即測定結(jié)果。在 450 nm 波長測定各孔的值。

1.2.4 脫細(xì)胞尾腱復(fù)合大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)及觀察 取適量無菌脫細(xì)胞尾腱于 6 孔板中，每個(gè)孔板加入 3 × 106個(gè)第二代大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。然后注入含 10% FBS、1%雙抗的低糖 DMEM 培養(yǎng)液，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。1 d 和 7 d 后取出細(xì)胞-支架復(fù)合物進(jìn)行死活細(xì)胞染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀測細(xì)胞存活情況。

1.2.5 細(xì)胞生物相容性檢測 在 96 孔板中配制 100 μl 的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在 37 ℃、5% CO2條件下預(yù)培養(yǎng) 24 h。按照 CCK-8 試劑說明書制備適量浸提液，向培養(yǎng)板加入 10 μl 浸提液，然后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育 1、2、3、4、5、6 d。向每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 ~ 4 h，最后用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 脫細(xì)胞尾腱大體觀以及組織學(xué)觀察

脫細(xì)胞前大鼠尾腱呈瓷白色條束狀，組織形態(tài)完整，表面光滑（圖 1A）；脫細(xì)胞后大鼠尾腱稍透明，體積增大，束狀形態(tài)不明顯，局部形成膠凍狀形態(tài)（圖 1B）；風(fēng)干冷凍后有一定孔隙率（圖 1C）。HE 染色示大鼠尾腱脫細(xì)胞前組織排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，組織內(nèi)肌腱細(xì)胞藍(lán)染，細(xì)胞排列有序呈串珠樣（圖 1D）；大鼠尾腱脫細(xì)胞后，組織排列疏松，體積增大，幾乎未見肌腱細(xì)胞殘留（圖 1E）。DAPI 染色示大鼠尾腱脫細(xì)胞前組織內(nèi)可見大量細(xì)胞核藍(lán)染（圖 1F），排列緊密而有序；脫細(xì)胞后組織見少量細(xì)胞核殘留（圖 1G）。

2.2 脫細(xì)胞前后α-Gal 含量檢測結(jié)果

對三組大鼠尾腱樣本脫細(xì)胞前后 α-Gal 含量檢測結(jié)果（圖 2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05），顯示脫細(xì)胞前后大鼠尾腱 α-Gal 含量有差異。脫細(xì)胞后大鼠尾腱殘留 α-Gal 含量明顯降低。

2.3 脫細(xì)胞尾腱復(fù)合大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)觀察結(jié)果

脫細(xì)胞尾腱與大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)死活細(xì)胞染色顯示：1 d 時(shí)大量活細(xì)胞貼附，并且有較高的活性，少量死細(xì)胞出現(xiàn)（圖 3A）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)增，到 7 d 時(shí)細(xì)胞活性也明顯提高，未見死細(xì)胞數(shù)量明顯改變（圖 3B）。

2.4 細(xì)胞生物相容性檢測

在培養(yǎng)周期內(nèi)值總體呈上升趨勢，實(shí)驗(yàn)組在各時(shí)間點(diǎn)測得的值高于對照組，但是差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，這種大鼠尾腱脫細(xì)胞后生物相容性好，沒有細(xì)胞毒性，不會影響細(xì)胞正常的生長以及增殖（圖 4）。

Figure 1 Preparation and observation of rat tail tendon (A: General morphology of rat tail tendon; B: Observation of decellularized rat tail tendon; C: The morphology of decellularized rat tail tendon after drying and freezing; D: HE staining of rat tail tendon; E: HE staining of decellularized rat tail tendon; F: DAPI staining of rat tail tendon; G: DAPI staining of decellularized rat tail tendon; Scale: 200 μm)

3 討論

肌腱損傷經(jīng)常發(fā)生在體育活動和其他高強(qiáng)度的體力勞動中，一旦損傷容易導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn)以及異常的關(guān)節(jié)活動[6]。肌腱損傷的自我修復(fù)往往導(dǎo)致瘢痕組織形成，這使得肌腱組織力學(xué)性能降低，通常造成二次損傷。因此，肌腱損傷的功能性修復(fù)仍然是臨床骨科面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。目前，有多種治療肌腱損傷的方法，包括自體移植、同種異體移植、異種移植、縫合技術(shù)、肌腱假體修復(fù)等。然而，這些方法的遠(yuǎn)期治療效果往往欠佳，不可避免地引起供體損傷、組織的排異反應(yīng)和肌腱損傷復(fù)發(fā)等[7-10]。這些局限促使了肌腱組織工程的快速發(fā)展，目前，組織工程技術(shù)在肌腱損傷的修復(fù)中具有廣闊的前景。

肌腱組織工程包括種子細(xì)胞、支架、生物活性因子等，其中支架材料是必不可少的一個(gè)關(guān)鍵因素。合適的支架不僅能夠維持一定的生物力學(xué)性能，還可以給種子細(xì)胞提供一個(gè)良好的生長增殖環(huán)境[11]。基于這種理論，目前越來越多的生物源性材料（如細(xì)胞外基質(zhì)）被應(yīng)用于組織工程技術(shù)中[12]，其中肌腱細(xì)胞外基質(zhì)是組織工程肌腱修復(fù)中一種常用的生物材料。在正常組織中，細(xì)胞外基質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)，占據(jù)著細(xì)胞間的空間，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)、生長增殖的調(diào)控以及力學(xué)支撐[13]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肌腱細(xì)胞外基質(zhì)富含大量的基質(zhì)蛋白，它能促進(jìn)種子細(xì)胞增殖以及向肌腱方向分化，同時(shí)維持干細(xì)胞表型，抑制異位骨化[14]。此外，肌腱細(xì)胞外基質(zhì)源性支架明顯增強(qiáng)修復(fù)組織的力學(xué)性能，同時(shí)通過抑制或者激活種子細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）來調(diào)控肌腱損傷的修復(fù)過程[15]。

圖 2 大鼠尾腱脫細(xì)胞前后 α-Gal 含量的比較

Figure 2 Comparison of the content of α-Gal in rat tail tendon before and after decellularization

圖 3 脫細(xì)胞尾腱復(fù)合脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)（A：共培養(yǎng) 1 d 大量活細(xì)胞貼附；B：共培養(yǎng) 7 d 活細(xì)胞數(shù)目增多，視野內(nèi)見少量死細(xì)胞，標(biāo)尺：100 μm)

Figure 3 Co-culture of decellularized rat tail tendon and ADSCs (A: A large number of living cells were attached at the 1 day of co-culture; B: The number of living cells was increased and a few dead cells were observed in the field of vision after 7 days co-culture. Scale: 100 μm)

目前，肌腱組織脫細(xì)胞方法主要有物理方法、化學(xué)試劑法和生物制劑法[16]。常用的物理方法包括機(jī)械攪拌、凍融法、加壓、超聲處理等，但由于單純物理方法的脫細(xì)胞效果不佳，通常需要結(jié)合不同的脫細(xì)胞試劑配合使用?；瘜W(xué)試劑有酸堿溶液、非離子型洗滌劑、離子型洗滌劑等。酸堿溶液最常見的有乙酸、過氧乙酸、透明質(zhì)酸，這些試劑能夠有效地破壞細(xì)胞膜以及細(xì)胞器，但同時(shí)還會影響 ECM 內(nèi)的其他成分如糖胺聚糖（GAG）、細(xì)胞因子的活性，從而降低 ECM 的性能。非離子洗滌劑主要有曲拉通（Triton-100），它是應(yīng)用和研究最廣泛的洗滌劑之一，去細(xì)胞的作用極強(qiáng)，但同時(shí)往往會破壞 ECM 中的蛋白成分以及糖胺聚糖，適用于肥厚堅(jiān)硬的組織，此外 Triton-100 對細(xì)胞還有較強(qiáng)的毒性[17]。生物制劑主要指的是酶類和非酶類試劑，酶類包括胰蛋白酶、核酶，非酶類試劑包括螯合劑，如 EDTA 和乙二醇二乙醚二胺四乙酸等。酶類試劑主要通過破壞核酸序列來瓦解細(xì)胞，能有效去除細(xì)胞內(nèi)的核酸成分，但是需要適度的溫度與 pH 值，因此酶類脫細(xì)胞效果一般，而且通常與其他試劑配合使用。而螯合劑是通過分離型金屬離子對組織脫細(xì)胞起輔助作用，它能破壞蛋白-蛋白間的聯(lián)系。但螯合劑對去除組織表面的細(xì)胞無效，因此常和酶類或洗滌劑聯(lián)合使用[18]。

圖 4 CCK-8 檢測（在同一時(shí)間點(diǎn)，兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P > 0.05）

Figure 4 CCK-8 test (At the same time, there was no statistically significant difference between the two groups,> 0.05)

本文大鼠尾腱組織異常薄，通過剪碎后體積較小，因此采用反復(fù)凍融結(jié)合 SDS 脫細(xì)胞的方法制備肌腱細(xì)胞外基質(zhì)。反復(fù)凍融可充分破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且不會造成 ECM 蛋白成分的明顯損失及影響 ECM 的超微結(jié)構(gòu)。SDS 屬于離子洗滌劑，是較強(qiáng)的脫細(xì)胞化學(xué)試劑。它能夠有效去除組織中細(xì)胞成分，將組織中殘留的細(xì)胞核成分以及蛋白徹底清除[19]。整個(gè) SDS 處理的過程是在恒溫?fù)u床上進(jìn)行的，能夠提高脫細(xì)胞的效率。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，該種脫細(xì)胞的方法效果很好，得到的肌腱細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞殘余量極少，免疫源性較低。這種脫細(xì)胞大鼠尾腱與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)不影響細(xì)胞的生長增殖，具備良好的生物相容性，未發(fā)現(xiàn)明顯的生物毒性，是組織工程肌腱技術(shù)中修復(fù)肌腱損傷的一種理想材料。由于本實(shí)驗(yàn)的局限性，這種大鼠尾腱脫細(xì)胞材料修復(fù)肌腱損傷的效果有待進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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Preparation method of extracellular matrix of rat tail tendon and its preliminary study on repair of tendon injury

ZHANG Kai-hong, LIU Xue-jian, SUN Bai-chuan, HUANG Shao-dai, LU Chang-feng, QU Peng-wei, HAN Yun-ning, YU Wen, SUN Xun, XU Wen-jing, WANG Ai-yuan, WANG Yu, LU Shi-bi, PENG Jiang, QI Jian-hong

Institute of Sports Medicine, Taishan Medical University, Shandong 271016, China (ZHANG Kai-hong, QU Peng-wei, HAN Yun-ning, QI Jian-hong); Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China (ZHANG Kai-hong, LIU Xue-jian, SUN Bai-chuan, HUANG Shao-dai, LU Chang-feng, YU Wen, SUN Xun, XU Wen-jing, WANG Ai-yuan, WANG Yu, LU Shi-bi, PENG Jiang)

To explore the preparation method of extracellular matrix of rat tail tendon, and to construct micro-tissue with adipose mesenchymal stem cells to provide the experimental basis for the repair of tendon injury.

20 SD rats (150 - 200 g) tails were used as experimental materials, the rat's tail tendons were extracted, washed thoroughly with PBS, frozen and thawed three times, then treated with 1% SDS at room temperature for 24 h. The cell debris was removed by washing with a large amount of PBS for 1 week, and finally60Co was disinfected for use. The pathological analysis of the material was carried out to observe the cell debris. Then, its α-Gal content was detected. In addition, the effects of complexed rat tail tendon extracellular matrix with adipose mesenchymal stem cells on cell proliferation were observed. At last, the cytotoxicity of the biomaterials was detected by CCK-8 kit.

The gross observation showed that the volume of the treated tail tendon was increased, and its shape was milky white homogenate. The results of HE and DAPI staining showed that the nucleus of the treated tail tendon was significantly reduced, the number of cells was decreased markedly, and the cells residue in each high magnification lens was not more than 5. The residual α-Gal content of the treated tail tendon was statistically different from that of the normal tail tendon. The number of living cells significantly increased after 7 days of co-culture. And the results of CCK-8 toxicity test showed that the biocompatibility of this treated tail tendon was good and no cytotoxicity was found.

The extracellular matrix of rat tail tendon prepared by this method can effectively remove the cell components, and have good biocompatibility with adipose mesenchymal stem cells, and can be used as a biomaterial to repair tendon injury.

Extracellular matrix; Tendon repair; Rat tail tendon

QI Jian-hong, Email: jhqi7281@163.com; PENG Jiang, Email:pengjiang301@126.com

國家自然科學(xué)基金（81572148）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YF C1102104）；北京市科技專項(xiàng)（Z161100005016059）；山東省衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃（2015WS0109）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2017LH018）

亓建洪，Email：jhqi7281@163.com；彭江，Email：pengjiang301@126.com

2018-03-14

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.004