10-去乙酰巴卡亭III-10-β-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶迭代飽和突變與活性位點分析

張育楠，陳天嬌，朱平

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10-去乙酰巴卡亭III-10-β--乙酰轉(zhuǎn)移酶迭代飽和突變與活性位點分析

張育楠，陳天嬌，朱平

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室/國家衛(wèi)生健康委員會天然產(chǎn)物生物合成重點實驗室

利用迭代飽和突變技術(shù)進一步提高10-去乙酰巴卡亭 III-10-β--乙酰轉(zhuǎn)移酶雙突變體DBATG38R/F301V的活性；通過丙氨酸掃描確定DBAT 活性中心的重要位點。

利用迭代飽和突變技術(shù)在現(xiàn)有雙突變體 DBATG38R/F301V的基礎(chǔ)上對 Ser396進行半飽和突變，篩選對10-去乙酰紫杉醇（DT）催化活性提高的突變體；對獲得的高活性突變體蛋白進行催化 DT 的最適溫度和最適 pH 測定；在最適 pH 條件下，將其分別用最適反應(yīng)溫度和 0 ℃溫育 6 h，考察該蛋白的熱穩(wěn)定性；采用生物信息學(xué)方法分析活性提高的分子機制。對 DBAT 底物結(jié)合區(qū)域尚未進行分析的幾個氨基酸進行丙氨酸掃描研究，分析這些位點在 DBAT 催化 10-DAB 和 DT 過程中的作用。

獲得了三突變體 DBATG38R/F301V/S396I，其催化 DT 的活性為 DBATG38R/F301V的 1.6 倍，該蛋白催化DT 的最適條件為 37.5 ℃，pH 7.5；該蛋白在 37.5 ℃靜置 6 h 后催化 DT 的活力為初始值的 30%，在 0 ℃靜置 6 h 后為初始值的 70%；丙氨酸掃描結(jié)果顯示，Asn45在 DBAT 催化 10-DAB 和 DT 時都非常重要，而 Asn42、Glu350、Glu355和Lys389位點對催化 10-DAB 的影響更大。

將活性口袋內(nèi)的親水性氨基酸向疏水性氨基酸突變可能有利于 DBAT 對 DT 的催化，但氨基酸側(cè)鏈的長度和空間構(gòu)型也是影響催化活性的重要因素；發(fā)現(xiàn) Asn45可能是一個潛在的 DBAT 催化或底物結(jié)合位點。

10-去乙酰巴卡亭III-10-β--乙酰轉(zhuǎn)移酶； 迭代飽和突變； 高活性突變體； 丙氨酸掃描； 潛在活性位點

10-去乙酰巴卡亭 III-10-β--乙酰轉(zhuǎn)移酶（10-deacetylbaccatin III-10-β--acetyltransferase，DBAT）催化紫杉醇生物合成途徑中的 10-去乙酰巴卡亭 III（10-deacetylbaccatin III，10-DAB）形成重要中間產(chǎn)物巴卡亭 III（baccatin III）[1]。編碼DBAT 的基因最初由 Walker 和 Croteau[2]從東北紅豆杉（）懸浮細胞 cDNA 中克隆得到，并在大腸桿菌內(nèi)實現(xiàn)了該酶的異源表達及功能鑒定。DBAT 是目前本實驗室建立的一鍋法雙酶促反應(yīng)從紫杉醇結(jié)構(gòu)類似物 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇（7-β-xylosyl-10-deacetytaxol，XDT）制備紫杉醇體系中的限速酶[3-5]。由 XDT 水解產(chǎn)生的 10-去乙酰紫杉醇（10-deacetytaxol，DT）與 10-DAB 只在 C13 位側(cè)鏈上存在差異，但該差異導(dǎo)致 DBAT 水解 DT 的活性遠低于其水解 10-DAB 的活性[3]。在前期研究中，我們推測并驗證了 DBAT 中可能參與底物催化的一些重要位點，還獲得了催化 DT 效率相比野生型提高近 6 倍的雙突變體 DBATG38R/F301V，該雙突變體被成功應(yīng)用到一鍋法反應(yīng)，在 50 ml 反應(yīng)體系中紫杉醇產(chǎn)量達到 0.64 mg/ml[3]。但相對于第一步反應(yīng)中的糖基水解酶 LXYL-P1-2[6-7]，DBATG38R/F301V的活性仍有待于進一步提高。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ser396位于酶活性口袋內(nèi)，但該位點可能不屬于活性中心[3]，可以用于定點突變研究以篩選活性得以提高的突變體。本文采用迭代飽和突變的方法，在 DBATG38R/F301V的基礎(chǔ)上對該位點進行半飽和突變，以期發(fā)現(xiàn)活性比 DBATG38R/F301V進一步提高的突變株。同時，我們還對 DBAT 活性中心附近的剩余“熱點”氨基酸殘基進行了丙氨酸掃描研究，以期確定它們的功能，或發(fā)現(xiàn)活性得以提高的突變體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 pCWori 表達載體由本室保存；pCWori-（pCWori 中連有東北紅豆杉來源的，且 N 端連有 6 × His tag）和 pCWori-G38R/F301V（pCWori-第 38 位的 Gly 突變?yōu)?Arg，第 301 位 Phe 突變?yōu)?Val）由本實驗室構(gòu)建；大腸桿菌（）Trans109 感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑TransStart FastPfu FlyDNA polymerase 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；鎳親和層析填料購自美國 GE Healthcare 公司；其他試劑、溶液、酶以及培養(yǎng)基均見參考文獻[3]。

1.1.3 儀器 Pro PCR 儀購自德國 Eppendorf 公司；mini transfer 購自美國 Bio-Rad 公司；Biospectrum AV system 購自美國 UVP 公司；3K15 型和 3K18 型低溫高速離心機購自美國 Sigma 公司；P300 型超微量分光光度計購自德國 Implen 公司；全溫振蕩搖床購自哈爾濱東聯(lián)科學(xué)儀器有限公司；FE20 型 pH 計購自瑞士 Mettler Toledo 公司；Labsolution 分析型高效液相（HPLC）分析工作站購自日本島津公司；APV-2000 型高壓細胞破碎儀購自德國 SPX 公司；HDL 超凈工作臺購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；超純水儀購自上海同田生物技術(shù)有限公司；Enspire 多標記微孔板檢測儀購自美國 PerkinElmer 公司；電熱恒溫水箱購自北京市長風(fēng)儀器儀表公司。

1.2 方法

1.2.1 丙氨酸掃描突變 參考文獻[3]方法，構(gòu)建相應(yīng)位點的丙氨酸掃描突變體質(zhì)粒，模板為pCWori-。PCR 引物序列如表 1 所示，突變后的密碼子以下劃線表示，“F”代表上游引物，“R”代表下游引物，所有引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系為50 μl，包括5 × TransStart FastPfu Fly buffer 10 μl，2.5 mmol/L dNTPs 5 μl，上下游引物各 2 μl，DNA 模板 5 ~30 ng，TransStart FastPfu Fly DNA 聚合酶 1 μl，加 ddH2O 至 50 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，1 個循環(huán)；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定并純化。純化后的 PCR 產(chǎn)物在 37℃經(jīng)I 酶切 3 h 后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Trans109 感受態(tài)細胞。

1.2.2 迭代飽和突變 即以pCWori-G38R/F301V為模板，以引物 S396X-F 和 S396X-R（表 1）進行全質(zhì)粒PCR 擴增，在原來雙突變的基礎(chǔ)上引入396 位點的半飽和突變，構(gòu)建一系列突變體質(zhì)粒。PCR 反應(yīng)條件同 1.2.1。

表 1 突變體及相應(yīng)引物

1.2.3 突變體菌株培養(yǎng)和蛋白誘導(dǎo)表達 突變體菌株培養(yǎng)和蛋白誘導(dǎo)表達及蛋白純化和濃度測定參照文獻[3]。

1.2.4 巴卡亭III和紫杉醇的標準曲線繪制 精密稱取巴卡亭 III 10.0 mg，色譜純甲醇溶解，配制一系列濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25 μmol/L；精密稱取紫杉醇 5.30 mg，甲醇溶解，配制一系列濃度梯度：125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625 μmol/L。

HPLC 分析條件：色譜柱為Cosmosil-C18，流速為 1 ml/min，柱溫為 28 ℃，檢測波長為 230 nm，進樣量 50 μl，流動相為乙腈和水，梯度洗脫條件如表 2 所示。根據(jù)峰面積和對應(yīng)的濃度，得到以濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）的回歸方程。

表 2 梯度洗脫條件

巴卡亭 III 的線性回歸方程為：Y = 82225X + 1E + 06，2= 0.9996；紫杉醇的的線性回歸方程為：Y = 91206X – 11087，2= 0.9999。

1.2.5 突變體催化 DT 的最適條件測定 DBAT 突變體催化 DT 的最適 pH 和最適溫度的測定反應(yīng)體系同文獻[3]。最適 pH 測定的反應(yīng)條件為37.5 ℃；最適溫度測定的反應(yīng)條件為 pH 7.5（50 mmol/L 的磷酸鈉緩沖液）；均反應(yīng) 3 h 后加入 400 μl 無水甲醇終止反應(yīng)，HPLC 檢測 DT 轉(zhuǎn)化情況，HPLC 條件同 1.2.4。

1.2.6 突變體的熱穩(wěn)定性 將上述反應(yīng)體系置于 50 mmol/L pH 7.5 的磷酸鈉緩沖液中，分別于 37.5 ℃下靜置 0、3、6 h，0 ℃下靜置 0、2、4、6 h，按 1.2.5 所述方法測定酶催化 DT 的活性。

1.2.7 突變體催化 DT 的活性測定 突變體催化 DT 的活性測定參照文獻[3]。

1.2.8 DBAT 突變體與底物 DT 的分子對接分析 在前期獲得的野生型 DBAT 模擬三維結(jié)構(gòu)和 docking 結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用 Chimera 軟件中的 Tools → Structure editing → Rotamers 工具對野生型 DBAT 三維結(jié)構(gòu)中的相關(guān)位點進行突變，突變后的氨基酸殘基選擇能量最優(yōu)構(gòu)象，分析突變后的氨基酸殘基與底物 DT 的相互作用。

2 結(jié)果

2.1 Ser396半飽和突變體蛋白的活性檢測

為節(jié)約篩選時間，提高篩選效率，我們通過迭代飽和突變（ISM）的方法[8]直接在DBATG38R/F301V的基礎(chǔ)上繼續(xù)進行Ser396位點的半飽和突變。經(jīng)過測序驗證，共獲得了 10 個Ser396位點突變體，其中 S396R（為方便敘述，DBATG38R/F301V/S396R簡稱為 S396R，下同）、S396N、S396D、S396H、S396Y、S396G、S396C 和 S396V 沒有檢測到對非天然底物 DT 的催化活性，S396L 突變體依然保留著對非天然底物 DT 的催化活性，但活性有所下降，S396I 對DT 的催化活性有顯著提高，分別達到 DBATG38R/F301V的 1.6 倍和野生型 DBAT 的 5.8 倍（圖 1）。

2.2 DBATG38R/F301V/S396I催化 DT 的最適條件和熱穩(wěn)定性

對獲得的高活性突變體蛋白進行進一步研究，如圖 2A、B 所示，突變體蛋白DBATG38R/F301V/S396I催化非天然底物 DT 的最適溫度為 37.5 ℃，最適 pH 為 7.5。熱穩(wěn)定性顯示，在 37.5 ℃靜置 3 h后，DT 的相對轉(zhuǎn)化率為初始值的 75%，在 37.5 ℃靜置 6 h 后催化 DT 的相對轉(zhuǎn)化率為初始值的 30%（圖 2C），在 0 ℃靜置 6 h 后催化 DT 的相對轉(zhuǎn)化率為初始值的 70% 左右（圖 2D），說明雖然該突變體的活性與雙突變對照相比有顯著提高，但其在 0 ℃以上條件下不夠穩(wěn)定，需要繼續(xù)通過蛋白質(zhì)工程提高其熱穩(wěn)定性和（或）進一步提高其活性。

圖 1 DBATG38R/F301V/S396I的活性檢測

Figure 1 Activity of DBATG38R/F301V/S396I

2.3 結(jié)構(gòu)分析

Ser396位于酶分子與底物結(jié)合口袋內(nèi)部，但該位點不與底物直接相互作用（圖 3A）。而 S396I 突變提高了酶對 DT 的催化活性，可能的原因是：Ser 為親水性氨基酸，Ile 為脂肪族疏水性氨基酸，Ser396Ile 突變后增加了底物結(jié)合口袋的疏水性，該底物結(jié)合口袋和疏水性大分子底物 DT 的疏水性，相互作用增加，使底物更容易進入底物結(jié)合口袋，從而提高酶的催化活性。而 Ser396Leu 突變后活性卻沒有提高，推測氨基酸側(cè)鏈的取向也對底物的催化有重要影響，Ile 的側(cè)鏈取向（圖 3B）可能更有助于底物的結(jié)合。

2.4 丙氨酸掃描突變

參考文獻[3]，在之前工作的基礎(chǔ)上，我們選取了 DBAT 活性口袋附近的其他 5 個氨基酸位點進行丙氨酸掃描[9-10]（圖 4A）。將野生型 DBAT 的活性定義為 100%，各突變體蛋白催化天然底物 10-DAB 及非天然底物 DT 的活性測定結(jié)果如圖 4B 所示。當(dāng)以 10-DAB 為底物進行活性檢測時，發(fā)現(xiàn) N45A 位點突變造成活性完全喪失，N42A、E350A、E355A 和 K389A 突變的活性降低為對照的 20% 左右，說明除了本實驗室之前已確定的一些氨基酸殘基之外，Asn42、Asn45、Glu350、Glu355和 Lys389也可能參與了該酶對 10-DAB 的結(jié)合或催化。與上述結(jié)果相類似，當(dāng)以 DT 為底物進行活性檢測時，N45A 活性也完全喪失，N42A 和 E350A 突變活性下降約一半，E355A 和 K389A 突變體的活性下降較小。

圖 2 DBATG38R/F301V/S396I 的最適反應(yīng)條件和熱穩(wěn)定性（A：DBATG38R/F301V/S396I催化DT 的最適溫度；B：DBATG38R/F301V/S396I催化DT 的最適 pH；C：DBATG38R/F301V/S396I在37.5 ℃的穩(wěn)定性；D：DBATG38R/F301V/S396I在0 ℃的穩(wěn)定性）

Figure 2 Optimal condition and thermal stability of DBATG38R/F301V/S396I(A: Optimal temperature of DBATG38R/F301V/S396Iagainst DT; B: Optimal pH of DBATG38R/F301V/S396Iagainst DT; C: Thermal stability of DBATG38R/F301V/S396Iat 37.5 ℃; D: Thermal stability of DBATG38R/F301V/S396Iat 0 ℃)

圖 3 DBATG38R/F301V（A）和 DBATG38R/F301V/S396I突變體（B）與 DT 的分子對接局部圖

Figure 3 Docking results of DBATG38R/F301V(A) and DBATG38R/F301V/S396I(B) with DT

圖 4 丙氨酸掃描突變分析（A：DBAT 三維結(jié)構(gòu)分析；B：突變體活性分析）

Figure 4 Analysis of L-alanine scanning mutagenesis (A: Three-dimensional structure analysis of DBAT; B: Activity analysis of mutants)

3 討論

半理性設(shè)計所需突變體的庫容量遠少于定向進化隨機突變體的庫容量，可大大減少篩選工作量，但通常仍需要借助高通量篩選的方法對突變體庫進行篩選。文獻顯示，使用 NDT 簡并密碼子進行飽和突變時，單點突變的庫容量僅為 34，遠低于使用 NNK 兼并密碼子時的庫容量 94，且同時進行多點飽和突變時使用 NDT 簡并密碼子的優(yōu)勢尤為明顯，能有效減少庫容量，顯著增加有益突變體出現(xiàn)的概率[8]。本文即采用 NDT 簡并密碼子進行（半）飽和突變研究。迭代飽和突變是在選定區(qū)域內(nèi)進行反復(fù)飽和突變，在得到性能提高的突變體的基礎(chǔ)上再次進行飽和突變，最終得到性能最優(yōu)的突變體的方法[11-12]，本研究中，使用該方法在已有的活性提高的雙突變蛋白 DBATG38R/F301V的基礎(chǔ)上，成功獲得了活性進一步提高的三突變蛋白 DBATG38R/F301V/S396I。該突變體的最適溫度為 37.5 ℃，與突變之前的 DBATG38R/F301V相同；但其最適 pH 為 7.5，高于 DBATG38R/F301V的最適 pH5.5。由于溫度是進行酶促反應(yīng)的一個重要因素，本研究重點觀察了 DBATG38R/F301V/S396I的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)該蛋白對熱不穩(wěn)定，因此，還需要繼續(xù)通過蛋白質(zhì)工程提高其熱穩(wěn)定性和（或）進一步提高其活性。

通常位于酶活性口袋內(nèi)部或其附近的氨基酸突變會直接影響酶的活性口袋的空間結(jié)構(gòu)、電荷分布或疏水性，從而改變酶的催化特性。通過對 DBAT 活性口袋內(nèi)部或其附近的一些氨基酸進行突變研究有可能發(fā)現(xiàn)對 DT 催化活性進一步提高的突變體。Ser396位于酶分子與底物結(jié)合口袋內(nèi)部，在實驗室前期的丙氨酸掃描結(jié)果中，其突變?yōu)楸彼嶂蠡钚约s為野生型的 90%[3]，說明該位點可能不參與活性中心的構(gòu)成，所以在此基礎(chǔ)上對其進行半飽和突變以期發(fā)現(xiàn)活性提高的突變株。DBATG38R/F301V/S396I突變體在保持其他氨基酸不變的前提下，將親水性的 Ser 突變?yōu)槭杷缘闹咀灏被?Ile，結(jié)果表明，這種由親水性向疏水性氨基酸的突變可能有利于該酶對 DT 的催化。但側(cè)鏈的長度或側(cè)鏈的空間構(gòu)型也可能影響其活性，比如，同樣是脂肪族氨基酸，當(dāng) 396 位突變?yōu)?Leu 后，該酶的活性不升反降。又例如，該位點突變?yōu)?Val 和 Gly 后則活性完全喪失。

由于丙氨酸的 R-基團僅包含一個甲基，同時具有體積小、對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響較小的特點，因此“丙氨酸掃描技術(shù)”常被用于探究酶的活性位點[9-10]，有時丙氨酸掃描還能發(fā)現(xiàn)活性位點之外使酶的催化活性得到提高的點突變[3]。活性口袋內(nèi)丙氨酸掃描后活性降低的位點通常被認為是可能的底物結(jié)合（催化）位點。本研究中，我們通過丙氨酸掃描發(fā)現(xiàn)，Asn45位點對于兩種底物的催化都至關(guān)重要，有可能是該酶的底物結(jié)合或催化位點之一，進一步完善了本課題組之前的研究結(jié)果。而其他位點的突變對于 10-DAB 和 DT 的影響并不完全相同，這一現(xiàn)象再次表明，雖然 DT 與 10-DAB 母核相同，但由于 DT 的 C13 位側(cè)鏈的存在，造成其與 DBAT 結(jié)合后的空間取向與 10-DAB 存在差異，進而造成各個位點突變后突變體對兩種底物的催化活性改變亦不盡相同。今后擬開展 DBAT 對 DT 的 C13位側(cè)鏈適配性的研究，通過改變該酶活性腔的空間結(jié)構(gòu)，使 DT 更容易進入該活性腔，篩選活性和（或）穩(wěn)定性得到大幅度提高的 DBAT 突變體。

本研究通過改造酶活性口袋的催化環(huán)境，提高了其對 DT 的催化效率，加深了對 DBAT 突變體和 DT 相互作用機制的理解，為進一步開展 DBAT 的蛋白質(zhì)工程研究奠定基礎(chǔ)。

[1] Croteau R, Ketchum RE, Long RM, et al. Taxol biosynthesis and molecular genetics. Phytochem Rev, 2006, 5(1):75-97.

[2] Walker K, Croteau R. Molecular cloning of a 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase cDNA from Taxus and functional expression in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(2): 583-587.

[3] Li BJ, Wang H, Gong T, et al. Improving 10-deacetylbaccatin III-10-β-O-acetyltransferase catalytic fitness for Taxol production. Nat Commun, 2017, 8:15544.

[4] Chattopadhyay SK, Sharma RP, Kumar S. Process for the production of important taxol analogues 10-deacetyl taxol A, B, and C: US, 6028206. 2000-02-22.

[5] Sisti NJ, Swindell CS, Chander MC. Paclitaxel synthesis from precursor compounds and methods of producing the same: US, 5948919. 1999-09-07.

[6] Cheng HL, Zhao RY, Chen TJ, et al. Cloning and characterization of the glycoside hydrolases that remove xylosyl groups from 7-β-xylosyl-10-deacetyltaxol and its analogues. Mol Cell Proteomics, 2013, 12(8):2236-2248.

[7] Zhu P, Cheng HL, Zhao RY, et al. Glycosyl hydrolase with beta-xylosidase and beta-glucosidase activities and uses thereof: US, 9206405. 2015-12-08.

[8] Reetz MT, Kahakeaw D, Lohmer R. Addressing the numbers problem in directed evolution. Chembiochem, 2008, 9(11):1797-1804.

[9] Cotter PD, Deegan LH, Lawton EM, et al. Complete alanine scanning of the two-component lantibiotic lacticin 3147: generating a blueprint for rational drug design. Mol Microbial, 2006, 62(3):735-747.

[10] Nicole P, Couvineau P, Jamin N, et al. Crucial role of the orexin-B C-terminus in the induction of OX1 receptor-mediated apoptosis: analysis by alanine scanning, molecular modelling and site-directed mutagenesis. Br J Pharmacol, 2015, 172(21):5211-5223.

[11] Reetz MT, Carballeira JD, Vogel A. Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability. Angew Chem Int Ed Engl, 2006, 45(46):7745-7751.

[12] Reetz MT, Bocola M, Carballeira JD, et al. Expanding the range of substrate acceptance of enzymes: combinatorial active-site saturation test. Angew Chem Int Ed Engl, 2005, 117(27):4264-4268.

Iterative saturation mutagenesis and active site analysis of 10-deacetylbaccatin III-10-β--acetyltransferase

ZHANG Yu-nan, CHEN Tian-jiao, ZHU Ping

State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of the National Health Commission, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

The study aims to improve the enzyme activity of DBATG38R/F301Vthrough iterative saturation mutagenesis, and identify the catalytic/substrate binding sites of DBAT by L-alanine scanning method.

Iterative saturation mutagenesis method was used to increase the DBAT activity against 10-deacetyltaxol (DT) through hemi-saturation mutation of Ser396on DBATG38R/F301V. The optimal reaction temperature and pH of the obtained mutant against DT were determined. Under the optimal pH its thermal stability was detected during the incubation period for up to 6 h at the optimal temperature and 0 ℃, respectively. The molecular mechanism for the improved enzyme activity was proposed based on the bioinformatics technology. L-alanine scanning mutagenesis was used to investigate the amino acids near the DBAT substrate binding region for their functions in catalyzing 10-DAB and DT.

A triple mutant DBATG38R/F301V/S396Iwith improved activity was obtained, which showed 1.6 times DT hydrolysis activity compared to the double mutant DBATG38R/F301V. It had an optimal temperature of 37.5 ℃ and an optimal pH of 7.5. In the thermal stability assay, it showed 30% of initial activity after incubation at 37.5 ℃ for 6 h, and maintained 70% of initial activity after incubation at 0 ℃ for 6 h. The Asn45of DBAT was determined as a crucial binding site for both 10-DAB and DT by L-alanine scanning of DBAT, while Asn42, Glu350, Glu355and Lys389were found to have more impact on the conversion of 10-DAB by DBAT.

Mutation from the hydrophilic amino acid to the hydrophobic aliphatic one in the active cave may help improve DBAT activity on DT. At the same time, the length and spatial configuration of the side chain of the amino acid are also important in affecting the enzyme activity; The Asn45was found to be a potential catalytic or substrate binding site of DBAT.

10-Deacetylbaccatin III-10-β--acetyltransferase; Iterative saturation mutagenesis; Highly active mutant; L-alanine scanning; Potential active site

ZHU Ping, Email: zhuping@imm.ac.cn

國家自然科學(xué)基金（81573325、31270796）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院“協(xié)和青年科研基金”（3332015137）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程重大協(xié)同創(chuàng)新項目（CIFMS-2017-I2M-2-004）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（2017PT35001）

朱平，Email：zhuping@imm.ac.cn

2018-08-30

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.001