microRNA-20a靶向調(diào)控唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST8SIA2在結(jié)直腸癌耐藥中的作用

宮曉紅，王丹，沈宗坤，賈莉，劉鈴

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microRNA-20a靶向調(diào)控唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST8SIA2在結(jié)直腸癌耐藥中的作用

宮曉紅，王丹，沈宗坤，賈莉，劉鈴

116013 遼寧，大連中醫(yī)醫(yī)院檢驗科（宮曉紅）；114002 遼寧，鞍鋼集團公司總醫(yī)院檢驗科（王丹）；123000 遼寧，阜新中心醫(yī)院檢驗科（沈宗坤）；116044 遼寧，大連醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院（賈莉）；118000 遼寧，丹東市第一醫(yī)院檢驗科（劉鈴）

探究基于 miR-20a 為探針調(diào)控 ST8SIA2 在結(jié)直腸癌耐藥中的功能和機制，為尋求逆轉(zhuǎn)藥物提供新的治療策略及靶點。

采用 RT-PCR、Western blot 分別檢測結(jié)直腸癌 Lovo 細胞及其耐藥細胞株 Lovo/5-FU 中 miR-20a、ST8SIA2 的表達水平；利用 CCK-8 及 Western blot 實驗檢測上調(diào)、下調(diào) miR-20a 后兩種細胞株的藥物敏感性及其 ST8SIA2 的表達情況；靶基因預測及雙熒光素酶報告實驗驗證 miR-20a 與 ST8SIA2的靶向關(guān)系；利用 CCK-8 實驗進一步檢測 Lovo 細胞中 miR-20a 和 ST8SIA2 表達調(diào)控對細胞藥物敏感性的影響。

①與 Lovo 細胞相比，miR-20a 在耐藥細胞株 Lovo/5-FU 中呈現(xiàn)高表達，ST8SIA2 呈現(xiàn)低表達；②特異性上調(diào) Lovo 細胞中 miR-20a 表達，ST8SIA2 表達減弱，該細胞的藥物敏感性減弱；③特異性下調(diào) Lovo/5-FU 細胞中 miR-20a 表達，ST8SIA2 表達增加，該細胞的藥物敏感性增強；④特異性上調(diào) Lovo 細胞中 ST8SIA2 表達，可逆轉(zhuǎn) miR-20a 對細胞產(chǎn)生的作用。

miR-20a 及 ST8SIA2 的表達水平與結(jié)直腸癌耐藥性密切相關(guān)，miR-20a 可能是通過靶向負調(diào)控ST8SIA2 的表達進而調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的耐藥。

結(jié)直腸腫瘤； miR-20a； ST8SIA2； 抗藥性，腫瘤

結(jié)直腸癌是人類高發(fā)的惡性腫瘤之一，是全球第二位癌癥相關(guān)死亡原因[1]。臨床中一些結(jié)直腸癌患者在數(shù)次化療后會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和進展，腫瘤細胞產(chǎn)生的耐藥是導致化療失敗的主要原因，增加結(jié)直腸癌細胞的化療敏感性尤為重要。

微小 RNAs（miRNAs）與惡性腫瘤的關(guān)系是近年來研究的熱點。miRNAs 可通過翻譯抑制或基因降解來調(diào)節(jié)基因表達[2]。研究表明，miR-20a 在結(jié)直腸癌的增殖、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起重要作用[3-4]。近年來研究表明，唾液酸糖基化修飾與腫瘤及其耐藥有著密切的聯(lián)系，但引起腫瘤的耐藥機制尚未明確。本文旨在探討 miR-20a 及唾液酸轉(zhuǎn)移酶 ST8SIA2 與結(jié)直腸癌耐藥的關(guān)系，從而為結(jié)直腸癌的治療提供新的策略及靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 結(jié)直腸癌細胞株 Lovo 及人胚腎細胞株 293T（雙熒光素酶報告實驗用）購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清購自美國 Hyclone 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基及青霉素、鏈霉素購自美國 Gibco 公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）購自美國 Sigma 公司；CCK-8 試劑購自美國 Selleck 公司；PVDF 膜購自美國 Pall 公司；兔抗鼠 ST8SIA2 多克隆抗體和兔抗鼠 GAPDH 多克隆抗體均購自英國 Abcam 公司；ECL 發(fā)光試劑盒及Quanti Tect Reverse Transcription Kit 購自美國 Thermal Fisher Scientific公司；Trizol 試劑、LipofectamineTM2000 及 ST8SIA2 pEGFP-N2 vector 均購自美國 Invitrogen 公司；miR-20a mimic/inhibitor 購自廣州銳博公司；雙熒光素酶報告質(zhì)粒 pmirGLO 購自吉瑪公司；DYY-12 型電泳儀購自北京六一儀器廠；RT-PCR 儀購自 Takara 公司；酶標儀購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；BM-66XB 型倒置熒光生物顯微鏡購自日本 Olympus 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國 Thermo 公司；低溫冰箱購自上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用 10% 體積的熱滅活胎牛血清，1% 體積的青霉素（100 μg/ml）、鏈霉素（100 μg/ml），90% 體積的 DMEM 培養(yǎng)基制成 Lovo 細胞培養(yǎng)液。取 10 ml 該培養(yǎng)液培養(yǎng) Lovo 細胞于培養(yǎng)瓶中，并置于 37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。采用藥物濃度遞增誘導法建立 Lovo 的耐藥細胞株，5-FU 藥物梯度由 0.1 逐漸到 2 μg/L 培養(yǎng)半年左右，以此得到的細胞株命名為 Lovo/5-FU，為了維持其耐藥性，該細胞株在含 2 μg/L的 5-FU 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，實驗前需停藥培養(yǎng)一周。

1.2.2 RNA 提取和 Real-time PCR 用 Trizol 法直接提取 Lovo、Lovo/5-FU 細胞的總 RNA。使用紫外分光光度計檢測所提取的總 RNA 濃度和純度。將提取的 RNA 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作。反轉(zhuǎn)錄體系為 20 μl，分別在 25 ℃反應5 min，在 42 ℃反應 60 min，在70 ℃反應 5 min。將上述反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 按照 SYBR Premix Ex Taq II加樣體系，置于 Real-time PCR 儀進行實時定量 PCR 擴增。反應體系總體積為 25 μl，分別在 95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火。延長 30 s，總共 40 個擴增循環(huán)。整個實驗過程重復進行 3 次。

1.2.3 免疫印跡分析 用 Lysis Buffer 裂解液裂解細胞，提取總蛋白，通過蛋白定量分析試劑盒定量蛋白質(zhì)。蛋白上樣前先煮沸 3 ~ 5 min 使其變性，用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白。每孔上樣量 40 μg 進行電泳，直到蛋白 marker 在 12% 的分離膠中完全分開。將目的蛋白所在位置的凝膠切下，通過轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的目的蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜放入 5% 脫脂牛奶（TTBS 配制）中，置于 37 ℃封閉 2 h。再分別與兔抗鼠 ST8SIA2（1:1000），GAPDH（1:1000）多克隆抗體 4 ℃孵育過夜。第二天取出 37 ℃搖膜 2 h，PBS 洗膜 4 次，每次 8 min。加 HRP 標記的羊抗兔 IgG（1:5000），于 37 ℃孵育 1.5 h，再洗膜 4 次，每次 8 min。用 ECL 發(fā)光試劑盒顯示條帶，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參進行對照分析。

1.2.4 體外藥敏分析 采用 CCK-8 法檢測Lovo、Lovo/5-FU 及轉(zhuǎn)染 miR-20a 后結(jié)直腸癌細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。取生長對數(shù)期細胞懸液 100 μl（5 × 104個/ml）接種于 96 孔培養(yǎng)板中，待其貼壁完全后，于各孔中分別加入 10 μl 相應藥物濃度的 5-FU。繼續(xù)培養(yǎng) 72 h 后，加入 11 μl 的 CCK-8 試劑，孵育 4 h 后，于 450 nm 處檢測其吸光度值。實驗中每個 96 孔板中設(shè)置一組陰性對照孔（不加細胞，其他試劑正常加），每種細胞對 5-FU 藥物設(shè)置一組陰性對照孔（不加藥，其他試劑正常加），陰性對照及實驗孔均做 5 個復孔。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗 設(shè)計與 miR-20a-5p 相結(jié)合的 ST8SIA2 的 3'UTR 序列以及突變序列，并分別將其構(gòu)建到雙熒光素酶報告基因載體 pmirGLO 上（由上海吉瑪公司合成）。取對數(shù)生長期的 293T 細胞，胰酶消化，重懸細胞至 15 × 104/ml，取 500 μl 接種于 24 孔板，于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。棄培養(yǎng)基，加入 500 μl 無血清培養(yǎng)基。根據(jù)所加質(zhì)粒和 RNA 的不同，共分 6 組（空質(zhì)粒 control-ST8SIA2 + miR-20a mimic，空質(zhì)粒 control-ST8SIA2 + miR-20a control，野生型質(zhì)粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a mimic，野生型質(zhì)粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a control，突變型質(zhì)粒 mu-ST8SIA2 + miR-20a mimic，突變型質(zhì)粒 mu-ST8SIA2 + miR-20a control），每組 4 個副孔。先在 EP 管中配好每孔所需物質(zhì)，即 100 μl無血清培養(yǎng)基，4 μl 質(zhì)粒（0.1 μg/μl），1 μl RNA（20 pmol/μl），2 μl Lip2000，混勻，室溫靜置20 min，之后分別加入相應孔板中。48 h 后，根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，裂解細胞，取細胞裂解液至 96 孔板，分別加入底物，進行螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性（作為內(nèi)參）檢測。比較野生型質(zhì)粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a mimic 組相對于野生型質(zhì)粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a control 組的螢火蟲熒光素酶活性變化量（經(jīng)海腎熒光素酶活性標準化后）。

1.2.6 免疫熒光分析 Lovo、Lovo/5-FU 細胞轉(zhuǎn)染 miR-20a mimic/inhibitor 后進行免疫熒光實驗，檢測轉(zhuǎn)染后 ST8SIA2 的表達。將上述細胞分別接種至小平皿中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜。第2 天貼壁后取出，PBS 清洗，用 10% 甲醛固定40 min。PBS 洗 3 次，加入 0.1% 的 Triton X-100 透化 5 min，用5% 的 BSA 室溫封閉 1 h。接著細胞與兔抗鼠特異性 ST8SIA2（1:1000）抗體 4 ℃孵育過夜。次日，平皿取出復溫 1 h，接著孵育二抗（1:400），在 37 ℃避光孵育 30 min。PBS 清洗 3 次，將樣品覆蓋 DAPI，室溫避光放置 10 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 miR-20a 和 ST8SIA2 在 Lovo 細胞及其耐藥細胞株中的差異表達

采用 RT-PCR 檢測 Lovo 及 Lovo/5-FU 細胞株中 miR-20a 和 ST8SIA2 的表達水平，采用 Western blot 檢測在兩細胞株中 ST8SIA2 的蛋白表達水平。如圖 1 所示，與親本 Lovo 細胞相比，miR-20a 在 Lovo/5-FU 細胞中高表達，ST8SIA2 的 mRNA 及蛋白均呈現(xiàn)低表達水平，表達差異具有統(tǒng)計學意義（< 0.05）。

圖 1 miR-20a、ST8SIA2 在 Lovo 及 Lovo/5-FU 細胞中的差異表達（*P < 0.05）

Figure 1 Differential expression of miR-20a and ST8SIA2 in Lovo and Lovo/5-FU cells were shown (*< 0.05)

圖 2 Lovo 及 Lovo/5-FU 細胞轉(zhuǎn)染 miR-20a 的轉(zhuǎn)染效率（A）和調(diào)控 miR-20a 的表達對結(jié)直腸癌細胞耐藥性有顯著影響（B）（*P < 0.05）

Figure 2 The transfection efficiency of miR-20a transfected with Lovo and Lovo/5-FU cells were shown (A) and regulation of miR-20a expression had a significant effect on drug resistance in colorectal cancer cells (B) (*< 0.05)

2.2 調(diào)控 miR-20a 的表達對結(jié)直腸癌細胞體外藥敏性的影響

為了驗證 miR-20a 是否參與結(jié)直腸癌耐藥，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，使 Lovo 中 miR-20a 表達升高，Lovo/5-FU 中 miR-20a 表達下降。RT-PCR 技術(shù)檢測其轉(zhuǎn)染效率，如圖 2A 所示，轉(zhuǎn)染前后 miR-20a 表達水平有顯著性變化（< 0.05）。CCK-8 法分析了過表達 miR-20a 的 Lovo 細胞及干擾了 miR-20a 的 Lovo/5-FU 細胞對不同濃度 5-FU 處理后的細胞生存率，結(jié)果如圖 2B 所示，過表達 miR-20a 后 Lovo 細胞對 5-FU 的敏感性下降；而干擾 miR-20a 的 Lovo/5-FU 細胞對 5-FU 的敏感性增加。

2.3 miR-20a 與 ST8SIA2 表達的相關(guān)性

采用 RT-PCR、Western blot 及免疫熒光對 ST8SIA2 的表達進行分析，圖 3A 結(jié)果顯示，Lovo 細胞過表達 miR-20a 后，ST8SIA2 的表達水平顯著下降；圖 3B 顯示 Lovo/5-FU細胞下調(diào) miR-20a 表達后，ST8SIA2 的表達水平顯著上升（< 0.05）。

2.4 ST8SIA2 是 miR-20a 的靶基因

生物信息學分析表明，ST8SIA2 是 miR-20a 的潛在靶標（圖 4）。為了驗證這一結(jié)論，我們進行了雙熒光素酶報告實驗，結(jié)果顯示（圖 4），與 wt-ST8SIA2 + miR-20a control 組相比，wt-ST8SIA2 + miR-20a mimic 組熒光素酶活性顯著降低（< 0.05），mu-ST8SIA2 + miR-20a mimic 組熒光素酶活性沒有變化，表明 miR-20a 可以靶向結(jié)合 ST8SIA2 的3'-UTR。

2.5 過表達 ST8SIA2 抑制 miR-20 對 Lovo 細胞藥敏性的影響

為進一步明確 miR-20a 與 ST8SIA2 對結(jié)直腸癌細胞耐藥的影響，我們對 Lovo 細胞進行了 miR-20a 和 ST8SIA2 的過表達。如圖 5 所示，只有 miR-20a 過表達時與對照組比，細胞存活率增加，其耐藥性顯著增加（< 0.05）。同時過表達 miR-20a 和 ST8SIA2 時，細胞的存活率下降，其耐藥性顯著降低（< 0.05）。

3 討論

近年來，隨著基因組學、蛋白組學、糖生物學的發(fā)展，尋找抗腫瘤治療的新策略正在向miRNA 等方面發(fā)展。關(guān)于 miRNA 與結(jié)直腸癌之間的關(guān)系，已有很多報道。有研究表明，MicroRNA-182 能夠促進結(jié)直腸癌的增殖及轉(zhuǎn)移[5]。結(jié)直腸癌中，MicroRNA-26b 靶向煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，起到抑制腫瘤的作用[6]。miR-20a 可靶向 BNIP2 促進結(jié)直腸癌細胞耐藥[7]。miR-149 可增強結(jié)直腸癌細胞對 5-FU 的敏感性[8]。結(jié)直腸癌細胞中存在異常表達的miRNA 受到更多人的關(guān)注。

圖 3 Lovo 細胞過表達 miR-20a 后，ST8SIA2 的表達水平（A）和 Lovo/5-FU 細胞下調(diào) miR-20a后，ST8SIA2 的表達水平（B）（*P < 0.05）

Figure 3 The levels of ST8SIA2 were revealed after Lovo cells overexpressed miR-20a (A) and the levels of ST8SIA2 were shown after Lovo/5-FU cells down-regulated miR-20a (B) (*< 0.05)

圖 4 miR-20a 可直接靶向結(jié)合 ST8SIA2 的 3'-UTR（*P < 0.05）

Figure 4 miR-20a could directly target the 3'-UTR of ST8SIA2 (*< 0.05)

在不同的腫瘤中，唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶的差異表達可作為癌癥的預后指標以及治療的潛在靶點[9]。有研究表明結(jié)直腸癌會發(fā)生糖基轉(zhuǎn)移酶表達的改變，如 ST6Gal1 在結(jié)腸癌中表達上調(diào)，并與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移正相關(guān)[10]。關(guān)于 ST8SIA2 與結(jié)直腸癌的關(guān)系鮮有報道，但是有研究稱 ST8SIA2 參與肝癌侵襲和耐藥的發(fā)展[11]。因此。本文通過探討 miR-20a 及唾液酸轉(zhuǎn)移酶 ST8SIA2 參與結(jié)直腸癌耐藥的可能機制，為診斷、治療結(jié)直腸癌耐藥提供新思路。

本研究中，我們采用 Real-time PCR 技術(shù)及Western blot 技術(shù)證實 ST8SIA2 在結(jié)直腸癌耐藥細胞株中的表達顯著高于結(jié)直腸癌敏感細胞株。進一步檢測了 Lovo 細胞與 Lovo/5-FU 細胞中 miR-20a的表達量，發(fā)現(xiàn)與Lovo 細胞相比，在Lovo/5-FU 細胞中miR-20a 的表達量顯著升高。為了驗證miR-20a 與結(jié)直腸癌耐藥的關(guān)系，我們上調(diào)了 Lovo 細胞中miR-20a 的表達，發(fā)現(xiàn)上調(diào) miR-20a 后 Lovo 細胞體外對藥物的耐藥性顯著升高。下調(diào)miR-20a 后，Lovo/5-FU 細胞對藥物耐藥性顯著降低。以上結(jié)果表明 miR-20a 參與了結(jié)直腸癌的耐藥，結(jié)直腸癌細胞對 5-FU 藥物的耐藥程度隨著 miR-20a 表達的增加而增強。我們對轉(zhuǎn)染后的細胞進行了 ST8SIA2 表達的檢測，發(fā)現(xiàn) miR-20a 與 ST8SIA2 的表達呈現(xiàn)負相關(guān)。因此，我們猜想 miR-20a 與 ST8SIA2 之間可能存在某種關(guān)聯(lián)。

圖 5 過表達 ST8SIA2 可逆轉(zhuǎn) miR-20a 對細胞藥物敏感性的作用（*P < 0.05）

Figure 5 Over expression of ST8SIA2 could reversed the effect of miR-20a on cellular drug sensitivity (*< 0.05)

為進一步了解miR-20a 在結(jié)直腸癌耐藥中如何發(fā)揮作用，我們意圖找到 miR-20a 的潛在靶點。靶基因預測表明，ST8SIA2 是 miR-20a 的潛在靶標。我們利用雙熒光素酶報告實驗，驗證了 ST8SIA2 確實是 miR-20a 的直接靶基因。之后我們對 Lovo 細胞進行了 miR-20a 和 ST8SIA2 的過表達，結(jié)果表明，過表達 ST8SIA2 后可逆轉(zhuǎn) miR-20a 對結(jié)直腸癌細胞的作用。本研究中，我們采用體外實驗初步探討了 miR-20a 參與結(jié)直腸癌耐藥的機制，并沒有進行體內(nèi)實驗及臨床標本的進一步驗證，我們將在后續(xù)工作中進行體內(nèi)的驗證及機制的深入研究。

綜上所述，miR-20a 與結(jié)直腸癌細胞耐藥的發(fā)生密切相關(guān)，并且可能是通過靶向負調(diào)控ST8SIA2 的表達進而促進結(jié)直腸癌的耐藥。明確 miR-20a 在結(jié)直腸癌耐藥中的作用機制，可為結(jié)直腸癌的治療提供新的策略。

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Effect of microRNA-20a on the colorectal cancer drug resistance by targeting ST8SIA2

GONG Xiao-hong, WANG Dan, SHEN Zong-kun, JIA Li, LIU Ling

Department of Clinical Laboratory, Dalian Traditional Chinese Medical Hospital, Liaoning 116013, China (GONG Xiao-hong); Department of Clinical Laboratory, General Hospital of Anshan Iron and Steel Group Corporation, Liaoning 114002, China (WANG Dan); Department of Clinical Laboratory, Fuxin Central Hospital, Liaoning 123000, China (SHEN Zong-kun); College of Laboratory Medicine, Dalian Medical University, Liaoning 116044, China (JIA Li); Department of Clinical Laboratory, Dandong First Hospital, Liaoning 118000, China (LIU Ling)

We aim to explore the mechanism of miR-20a to regulate ST8SIA2 in colorectal cancer drug resistance and to provide a novel therapeutic strategy and target of colorectal cancer.

The expression of miR-20a and ST8SIA2 was analyzed by real-time PCR and Western blot in colorectal cancer cells. CCK-8 and Western blot assays were used to detect the drug sensitivity and the ST8SIA2 expression in the two cell lines after up-regulation and downregulation of miR-20a, respectively. The interaction between miR-20a and its predicted target gene ST8SIA2 was confirmed by 3'-UTR dual-luciferase reporter assay. The cell viability was obtained to further investigate the drug sensitivity of Lovo cells upon transfection with miR-20a mimic and ST8SIA2.

miR-20a was highly expressed and ST8SIA2 lowly expressed in Lovo/5-FU cells. Overexpression of miR-20a in Lovo cells could decrease ST8SIA2 level, and decrease the chemosensitivity to anti-tumor drugs.Silencing of miR-20a in Lovo/5-FU cells resulted in the increased expression of ST8SIA2, and increased the chemosensitivity to anti-tumor drugs. Overexpression of ST8SIA2 could reversed the effect of miR-20a mimic on drug resistance.

The levels of miR-20a and ST8SIA2 were closely related to the drug resistance in colorectal cancer. miR-20a could regulate drug resistance in colorectal cancer cells by targeting ST8SIA2 expression.

Colorectal neoplasms; miR-20a; ST8SIA2; Drug resistance, neoplasms

LIU Ling, Email: 15614328@qq.com

劉鈴，Email：15614328@qq.com

2018-09-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.006