平板培養(yǎng)結(jié)合宏測(cè)序法調(diào)查小麥田土壤真菌多樣性

馬樂樂 翟妮平 馬慶周 郭玉霞 耿月華 張猛

摘要：從河南省商丘市小麥田里于揚(yáng)花期采集土樣3份，通過ITS2宏測(cè)序方法結(jié)合平板培養(yǎng)法研究了小麥揚(yáng)花期田間真菌種類，發(fā)現(xiàn)小麥田塊物種多樣性指數(shù)明顯大于甜瓜地塊，平均有1 630個(gè)OTUS。培養(yǎng)法獲得的主要菌株為枝細(xì)枝孢（Cladosporium ramotenellum）、疣孢漆斑霉（Myrothecium verrucaria）和鏈格孢（Alternaria alternata），并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行詳盡的描述。

關(guān)鍵詞：土壤真菌；宏測(cè)序；枝細(xì)枝孢；疣孢漆斑霉；鏈格孢

中圖分類號(hào)：S154.38 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）09-0119-04

Abstract Three soil samples were collected from wheat fields in Shangqiu City of Henan Province. The fungal species at the flowering stage of wheat were studies by ITS2 macro sequencing combined with plate culture method. The results showed that the species diversity index of wheat field was significantly greater than that of melon plots， for an average of 1 630 OTUS. The main strains obtained by culture were Cladosporium ramotenellum，Myrothecium verrucaria and Alternaria alternata， and their morphology was described in detail.

Keywords Soil fungi； Macro sequencing； Cladosporium ramotenellum； Myrothecium verrucaria； Alternaria alternata

河南是小麥種植大省，氣候處于亞熱帶溫帶過渡帶，四季分明，氣候非常適合小麥生長(zhǎng)，同時(shí)建有國(guó)家糧庫(kù)，在國(guó)家糧食安全上起著舉足輕重的作用。現(xiàn)在的主要種植制度為小麥和玉米輪作，這種輪作方式在土地利用上發(fā)揮了很好的時(shí)間優(yōu)勢(shì)[1]。其中秸稈還田是該種植制度下的主要耕作方式，并且有諸多好處[2-5]。秸稈尤其玉米秸稈還田后長(zhǎng)期不腐爛現(xiàn)象造成了很多病原菌的積累。土壤中的微生物是秸稈降解的主要參與者，但冬小麥和夏玉米輪作體系下的土壤絲孢真菌物種多樣性至今未有系統(tǒng)報(bào)道，本研究通過宏條形碼技術(shù)結(jié)合平板培養(yǎng)法對(duì)冬小麥和夏玉米輪作體系下土壤真菌的多樣性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

2017年4月在河南省商丘市采集多年小麥玉米輪作田塊土樣3份，編號(hào)為SQ425-1、SQ-2、SQ-3，另外采集一份甜瓜田塊土樣ZKG-1做對(duì)照，進(jìn)行室內(nèi)分離培養(yǎng)和ITS2宏測(cè)序分析。

可培養(yǎng)絲孢菌的研究方法：采用TWA稀釋平板法處理土壤樣品標(biāo)本，然后進(jìn)行單孢分離獲取目的菌株，進(jìn)行菌株保存和鑒定描述，詳細(xì)方法見參考文獻(xiàn)[6]。

免培養(yǎng)法研究菌種多樣性：采用試劑盒（MP Biomedicals， Solon， OH， USA）法提取土壤總DNA。用引物ITS3F （5′-GCATCGATGAAGAAC

GCAGC-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGA

TATGC-3′） 擴(kuò)增ITS2片段。PCR反應(yīng)體系為：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，所得產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收，送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用數(shù)據(jù)庫(kù)FLASH、QIIME、UNITE和INSDC分析土壤中真菌物種多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏測(cè)序結(jié)果

通過 ITS3F和ITS4引物對(duì)ITS2進(jìn)行宏測(cè)序，獲得序列片段大小約320 bp，小麥土壤樣品（SQ425-1、SQ-2、SQ-3）序列分別為57 861、55 367條和49 624條，平均54 284條，獲取的OTUS分別為1 824、1 380個(gè)和1 688個(gè)，平均為1 630個(gè)，對(duì)照組瓜田（ZKG-1）OTUS為1 273個(gè)（表1）。小麥田中的Shannon指數(shù)明顯大于瓜田且三塊小麥田的重復(fù)性較好，可見瓜田的物種多樣性指數(shù)明顯低于小麥田塊，同時(shí)小麥田的Simpson指數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于瓜田土壤，同樣反映了小麥田塊真菌的物種多樣性指數(shù)明顯較高。

通過樣品的OTUS聚類樹（圖1）可見，三個(gè)小麥重復(fù)樣品能很好地與瓜田土樣分開。在宏測(cè)序中獲得較多的OTUS為未分類群（unclassified），說明大多數(shù)宏測(cè)序得到的結(jié)果未能在數(shù)據(jù)庫(kù)匹配上具體的物種。獲得較多的菌種有鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、青霉屬（Penicillium）、腐質(zhì)霉屬（Humicola）和尾孢屬（Cercozoa），但是沒有檢測(cè)到漆斑霉（Myrothecium）。通過韋恩圖（圖2）可以看出，4份土樣中都有的OTUS有79個(gè)，而瓜田特有的有1 040個(gè)。

2.2 可培養(yǎng)真菌的形態(tài)學(xué)觀察

獲得的可培養(yǎng)真菌主要是枝細(xì)枝孢、疣孢漆斑霉和鏈格孢。

枝細(xì)枝孢在PDA培養(yǎng)基上菌落平展，絨狀，暗綠色。培養(yǎng)兩周后菌落直徑3 cm。菌絲近無色至淡褐色，有隔膜，光滑或密布小疣，偶分枝菌絲寬1.5～3.5 μm。分生孢子梗單生且間生或頂生于菌絲上，無色或淡褐色細(xì)線或闊線型，偶有分枝，直或者彎曲，不呈屈膝或“Z”字形彎曲（圖3）。產(chǎn)孢細(xì)胞頂生或側(cè)生，圓柱形。分生孢子間生或頂生，孢子鏈分枝；頂生的小孢子為單生球形或卵球形，大小3～5.5 μm×2～3 μm；間生的分生孢子圓柱形或橢圓形，無隔膜或一個(gè)隔膜，大小4～14 μm×3～4 μm；次級(jí)枝孢為圓柱形，0～2個(gè)隔膜，分隔處孢臍明顯。

疣孢漆斑霉菌落平整，初白色，后漸變?yōu)榛疑式q毛狀或疏松棉絮狀。生長(zhǎng)速度中等，25℃PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d菌落直徑達(dá)3 ～ 8.5 cm，培養(yǎng)基背面淡褐色或灰白色。菌絲體部分表生，部分埋生。菌絲光滑，有隔膜，無色或淡褐色，分枝，有時(shí)形成菌絲束，寬1.5～3 μm。產(chǎn)孢梗為單線形，具隔膜，端部分枝多呈青霉?fàn)钆帕?，近無色。產(chǎn)孢瓶體光滑，淡橄欖褐色，頂端明顯乳頭狀突出，無隔膜，大小4.5～21 μm×1.5～3 μm。分生孢子舟形、檸檬形，兩端尖細(xì)，基部半截，有時(shí)可見1～2個(gè)油滴，淡褐色，聚集在一起常為中等褐色或綠色，大小5.5～7.5 μm×2～3 μm（圖4）。

鏈格孢菌落平整，棉絮狀或絨狀，常為灰色及灰褐色，等徑生長(zhǎng)，速度中等，在25℃環(huán)境下PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d菌落直徑達(dá)3～6.5 cm。菌絲體淡褐色或無色，表生或埋生，有隔膜且常有分枝。分生孢子梗單生或簇生，直立或膝狀折曲（圖5）。分生孢子（孔出孢子）倒棍棒形、橢圓形，多胞，具有橫縱膈膜，暗色，鏈生或單生，孢子大小12～41 μm×7～14 μm，喙胞短或長(zhǎng)，長(zhǎng)喙有的一次分枝，具隔膜，淺色或無色。

3 討論與結(jié)論

宏條形碼技術(shù)是基于1998年Handelsman提出宏基因組學(xué)的方法而快速發(fā)展起來的新技術(shù)[7]，可以快速高效檢測(cè)土壤中的微生物動(dòng)態(tài)變化，也是真菌檢測(cè)方面常用的免培養(yǎng)方法。2011年，Mendes等[8]基于微矩陣芯片的宏條形碼技術(shù)和可培養(yǎng)功能分析方法研究了抑病土壤的根際微生物群落，發(fā)現(xiàn)變形菌門、厚壁菌門和放線菌門與疾病的抑制有關(guān)。2014年，Tedersoo等[9]獲取了全球365個(gè)土壤樣品的真菌ITS序列，發(fā)現(xiàn)氣候因子對(duì)土壤真菌的物種豐富度和群落組成影響最大，并直接或間接通過土壤和植物等因素的變化影響土壤真菌多樣性?，F(xiàn)在真菌宏條形碼技術(shù)一般通過ITS2片段測(cè)序進(jìn)行分析。本研究通過培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法發(fā)現(xiàn)排在前三名的真菌為枝細(xì)枝孢、疣孢漆斑霉和鏈格孢，均為腐生性，容易在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。不過鏈格孢是很多葉斑病的病原菌，更多情況是在病害發(fā)生后期復(fù)合侵染[10-12]。

對(duì)于小麥常見重要病原菌的測(cè)定，宏測(cè)序結(jié)果不太理想，有少量的鐮刀菌，但是沒有Bipolaris菌種，而前人在該時(shí)期小麥土壤中發(fā)現(xiàn)較多的Bipolaris菌。鐮刀菌是重要的小麥病原菌，尤其赤霉病危害嚴(yán)重[13-16]，但是在ITS2的宏測(cè)序中并沒有發(fā)現(xiàn)這個(gè)特點(diǎn)，可能是由于目的片段太短，所以不能確定到種。本方法中能夠獲得兩屬的部分菌株，但生長(zhǎng)量不多。ITS是重要的真菌分子鑒定條形碼，通過宏測(cè)序ITS1或者ITS2，得到300 bp左右的片段，在鑒定上很難達(dá)到物種水平。這兩個(gè)方法暫時(shí)很難統(tǒng)一起來，所具有的數(shù)據(jù)也不在一個(gè)數(shù)量級(jí)別，以后還要在宏測(cè)序上繼續(xù)擴(kuò)大測(cè)序片段以求鑒定到種的級(jí)別。

小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，目前尚未有對(duì)其土壤真菌物種資源多樣性的系統(tǒng)研究，而對(duì)其資源的挖掘?qū)椴『G色防控、秸稈降解奠定重要資源基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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