生防酵母菌株的分離篩選及其防治蘋果果實(shí)輪紋病效果

戴忠良 高克祥

摘要：為有效防控采后蘋果果實(shí)輪紋病，從泰安市三地果園不同果樹的葉片和果實(shí)中分離出30株酵母菌，分別進(jìn)行離體抑菌活性測(cè)定和活體防病效果篩選，其中4株酵母菌抑菌活性較強(qiáng)，對(duì)4株酵母菌不同處理液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響、不同濃度下的防治效果及在蘋果果實(shí)上的生長(zhǎng)定殖動(dòng)態(tài)等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：酵母菌株H3、T2、T3、Z8對(duì)蘋果輪紋病菌抑菌作用較強(qiáng)，第8 d的抑菌率分別為91.46%、91.06%、77.20%、88.66%。接種濃度為1×108 cfu/mL的酵母菌7 d后，其防病效果分別是65.1%、82.5%、69.8%、84.1%。培養(yǎng)原液和菌懸液對(duì)病原菌抑制作用較強(qiáng)，菌落平均直徑小于4 cm。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)只有菌株T3具有重寄生作用。酵母菌與病菌菌絲共培養(yǎng)試驗(yàn)中，酵母菌對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的抑制率都在99%以上。酵母菌濃度越高，防病效果越好，其中菌株Z8的防治效果達(dá)到59.4%。4株酵母菌在YPD培養(yǎng)基和蘋果傷口中呈指數(shù)型增長(zhǎng)，在YPD培養(yǎng)基中24 h達(dá)到峰值，在蘋果傷口上48 h達(dá)到峰值。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)初步鑒定，4株酵母菌均屬于季也蒙邁耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）。

關(guān)鍵詞：酵母菌；果蔬采后病害；蘋果果實(shí)輪紋?。晦卓棺饔?；生物防治

中圖分類號(hào)：S436.611.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）09-0102-07

Abstract In order to prevent and control apple fruit ring rot effectively， 30 yeast strains were isolated from the leaves and fruits in three orchards in Taian. Their inhibition activity and disease prevention effects were screened in vivo， and four strains were selected with stronger bacteriostasis.The effects of different treatment solutions of the four yeast strains on the growth of pathogen， the control effect of different concentrations and the growth and colonization on apple fruit were studied. The results showed that the yeast strains H3， T2， T3 and Z8 had stronger inhibition against pathogen of apple fruit ring rot， and their inhibition rates were 91.46%， 91.06%， 77.20% and 88.66%， respectively. After inoculation with 1×108 cfu/mL yeast for 7 d， the disease control effect was 65.1%， 82.5%， 69.8% and 84.1%， respectively. The inhibitory effect of yeast culture solution and yeast cell suspension on pathogens was stronger， and the average diameter of colonies was less than 4 cm. Microscopic observation showed that only strain T3 had mycoparasitism. In the co-culture experiment of yeast and pathogen mycelium， the inhibition rate of yeast to mycelia growth was over 99%. The higher the yeast concentration， the better the disease control effect and the control effect of strain Z8 reached 59.4%. The concentration of the 4 yeast strains increased exponentially in YPD medium and apple wounds. The peak reached after 24 h in YPD medium， and 48 h on apple wound. According to morphological and molecular biology， the 4 yeast strains were preliminarily identified as Meyerozyma guilliermondii.

Keywords Yeast； Postharvest diseases of fruits and vegetables； Apple fruit ring rot； Antagonism； Biocontrol

果蔬采后病害造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，目前主要防治方法是使用化學(xué)殺菌劑，但化學(xué)方法存在增強(qiáng)病原菌抗藥性、危害環(huán)境和人體健康等問題。生物防治具有長(zhǎng)效、環(huán)保、安全的特點(diǎn)，逐漸受到人們青睞。研究結(jié)果表明，對(duì)果蔬采后病害有生防作用的微生物有細(xì)菌、霉菌和酵母菌等[1]。其中酵母菌具有拮抗效果好、安全、抗逆性強(qiáng)、繁殖速度快、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)已報(bào)道的對(duì)果蔬采后病害具有明顯抑菌作用的酵母菌有20多種，例如隱球酵母屬的Cryptococcus infirmo-miniatus、羅倫隱球酵母（C. laurentii）和紅酵母屬的粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）對(duì)梨病害有較好的抑菌效果，C. infirmo-miniatus和粘紅酵母在采收前一天對(duì)梨進(jìn)行處理，能有效控制梨的采后腐爛[2]；Mercier等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，季也蒙假絲酵母（Candida guilliermondii）對(duì)由灰葡萄孢霉及黑曲霉引起的葡萄腐爛具有明顯的抑制效果，與只接種病菌的對(duì)照相比，分別可以減少16.81%和60.00%的腐爛損失。

富士蘋果對(duì)輪紋病菌高度感病，尤其在膠東半島、華北等中部高溫多雨地區(qū)發(fā)生普遍[4]。蘋果輪紋病既可以危害枝干，又可以直接侵染果實(shí)甚至潛伏至儲(chǔ)藏期危害采后果實(shí)。蘋果果實(shí)往往從接近成熟時(shí)開始發(fā)病，可持續(xù)至儲(chǔ)藏期，嚴(yán)重年份蘋果果實(shí)損失超過70%。蘋果輪紋病已成為重要的采后病害，給蘋果采后儲(chǔ)藏造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。因此，迫切需要研究安全有效的生物防治方法。

本試驗(yàn)的目的主要是篩選對(duì)蘋果果實(shí)輪紋病有開發(fā)應(yīng)用潛力的拮抗酵母菌株，研究不同酵母菌處理液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響、不同濃度酵母菌對(duì)蘋果輪紋病的防治效果、酵母菌在蘋果果實(shí)上的生長(zhǎng)定殖動(dòng)態(tài)等，以期為拮抗酵母菌在防治果蔬采后病害中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌菌株

蘋果果實(shí)輪紋病菌[貝倫格葡萄座腔菌（Botryosphaeria berengeriana）]為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2 供試蘋果

供試蘋果采購(gòu)于泰安市水果批發(fā)市場(chǎng)。選擇無(wú)病害、無(wú)傷口、成熟度和大小一致的富士蘋果，0℃下貯藏，備用。

1.3 酵母菌的分離與純化

1.3.1 樣本的采集 2016年9—10月分別從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校植保試驗(yàn)站、山東省泰安市省莊鎮(zhèn)許家埠村、泰安市道朗鎮(zhèn)玄家莊村采集蘋果、桃、柿子、棗、海棠等的果實(shí)、葉片和土壤樣品。采樣方法：①果實(shí)樣品：不同地點(diǎn)隨機(jī)取樣，分別取健康和有傷口的果實(shí)兩種，裝入塑料袋內(nèi)并標(biāo)記時(shí)間、地點(diǎn)和品種。②葉片樣品：不同地點(diǎn)隨機(jī)剪取葉片，裝入塑料袋內(nèi)，標(biāo)記時(shí)間、地點(diǎn)和品種。③土壤樣品：在樹冠滴水線處，用取樣鏟將表層5 cm左右的浮土除去，取5～15 cm處的土樣約10～20 g，裝入樣品袋并標(biāo)記地點(diǎn)、時(shí)間及環(huán)境條件。樣品取回后，及時(shí)晾干。壓碎后過孔徑為0.6 mm篩，備用。

1.3.2 酵母菌的分離與純化 ①表面分離法：參考Janisiewicz 等[6]的方法，取每個(gè)品種果實(shí)數(shù)個(gè)于大燒杯中，加入適量濃度為0.05 mol/L、pH 6.8的磷酸緩沖液，100 r/min振蕩10 min。棄去洗液，再將果實(shí)放入磷酸緩沖液中，用超聲波清洗30 min，取洗液。將洗液梯度稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6，各取100 μL分別涂布于PDA 培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落在新PDA平板上劃線，2 d后進(jìn)行鏡檢，對(duì)酵母或類似酵母的單菌落進(jìn)行單細(xì)胞純化培養(yǎng)。葉片樣品同樣采用表面分離法。②土壤梯度稀釋分離法：參照方中達(dá)[7]的方法，稱取研細(xì)的土樣5 g，加入盛有45 mL滅菌水的三角瓶中，充分振蕩10 min，制成1∶ 10濃度的土壤懸浮液。待土粒沉淀后，將土壤懸浮液梯度稀釋成10-3、10-4、10-5，各取100 μL分別于PDA培養(yǎng)基上涂布，25℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落在新PDA平板上劃線，2 d后進(jìn)行鏡檢，對(duì)酵母或類似酵母的單菌落進(jìn)行單細(xì)胞純化培養(yǎng)。

1.3.3 培養(yǎng)基 ①PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL，自然pH。如制固體培養(yǎng)基加入20 g瓊脂。121℃高溫高壓蒸汽滅菌25 min。②YPD培養(yǎng)基：A液：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，加水定容至900 mL，自然pH。B液：葡萄糖20 g，加水定容至100 mL，自然pH。121℃高溫高壓蒸汽滅菌25 min。A液∶ B液=9∶ 1混合均勻使用。

1.4 酵母菌株離體抑菌與活體防病試驗(yàn)

1.4.1 酵母菌懸液的制備 將已純化的酵母菌接種在YPD培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的菌液6 000 r/min離心10 min，棄上清，無(wú)菌水反復(fù)清洗離心3次（去除培養(yǎng)基），用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并配成濃度為1×108 cfu/mL的酵母菌懸液，備用。

1.4.2 離體抑菌試驗(yàn) 取100 μL濃度為1×108 cfu/mL的酵母菌懸液均勻涂布在PDA平板上，在PDA平板中心放置培養(yǎng)5 d、直徑為4 mm的病原菌菌餅，25℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌絲生長(zhǎng)情況。4 d后采用十字交叉法測(cè)量病原菌的菌落直徑。每處理重復(fù)3次，無(wú)菌水處理作為對(duì)照。

抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100 。

1.4.3 活體防病試驗(yàn) 選取無(wú)病、無(wú)傷口、成熟度和大小一致的富士蘋果，用2%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，自來(lái)水沖洗干凈，自然晾干，備用。在果實(shí)的腰部用消毒的打孔器打3個(gè)直徑和深度為4 mm的傷口，向每個(gè)傷口中注入30 μL濃度為1×108 cfu/mL的酵母菌懸液。取一塑料盒，在塑料盒底部鋪滿一層衛(wèi)生紙，倒入滅菌水，然后在衛(wèi)生紙上面緊密地放滿一層培養(yǎng)皿（防止蘋果直接接觸水，加速腐爛），將處理的蘋果放到培養(yǎng)皿上，保鮮膜覆蓋塑料盒進(jìn)行保濕，25℃恒溫培養(yǎng)。24 h后，將病原菌菌餅接種到傷口中，繼續(xù)25℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察并拍照，第7 d統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、病情指數(shù)和相對(duì)防治效果。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)6個(gè)果實(shí)，無(wú)菌水處理作為對(duì)照。蘋果果實(shí)輪紋病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，果實(shí)病斑直徑0～1 cm；1級(jí)，果實(shí)病斑直徑>1～2 cm；2級(jí)，果實(shí)病斑直徑>2～3 cm；3級(jí)，果實(shí)病斑直徑>3～4 cm；4級(jí)，果實(shí)病斑直徑>4～5 cm；5級(jí)，果實(shí)病斑直徑>5～6 cm。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病斑數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查病斑總數(shù)×最高級(jí)別代表的數(shù)值）×100 。

防治效果（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100 。

1.5 不同酵母菌處理液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

1.5.1 酵母菌處理液的制備 ①酵母菌懸液：方法同1.4.1。②酵母菌培養(yǎng)原液：取純化后酵母菌接種在30 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并配成1×108 cfu/mL的酵母菌培養(yǎng)原液，備用。③酵母菌高溫處理液：將酵母菌懸液于121℃高壓蒸汽滅菌25 min，備用。④酵母菌上清液：將30 mL酵母菌培養(yǎng)原液6 000 r/min離心7 min，取上清液并用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾（徹底除去酵母細(xì)胞），備用。

1.5.2 不同酵母菌處理液的抑菌試驗(yàn) 選取拮抗效果較好的4株酵母菌進(jìn)行試驗(yàn)。取0.1 mL酵母菌處理液涂布在PDA平板上，10 min后，在平板的中心接入培養(yǎng)5 d、直徑為4 mm的病原菌菌餅，25℃恒溫培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次，以涂布無(wú)菌水的PDA平板為對(duì)照。每天觀察并拍照，4 d后采用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑。

1.6 酵母菌對(duì)病原菌的重寄生作用和對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響試驗(yàn)

將培養(yǎng)5 d的蘋果輪紋病病原菌菌絲配成菌絲懸浮液。將10 mL菌絲懸浮液和供試酵母菌懸液（最終濃度1×104 cfu/mL）分別加到裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，25℃、80 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，5 d后于40倍顯微鏡下觀察。培養(yǎng)物用紗布過濾，收集病原菌菌絲，烘干后稱重。

抑菌率（%）=（對(duì)照菌絲干重-處理菌絲干重）/對(duì)照菌絲干重×100 。

1.7 不同濃度酵母菌對(duì)蘋果果實(shí)輪紋病的防治效果試驗(yàn)

方法同1.4.3活體防病試驗(yàn)。向不同傷口注入30 μL濃度分別為1×104、1×106、1×108 cfu/mL的酵母菌懸液。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)6個(gè)果實(shí)，無(wú)菌水處理作為對(duì)照。

1.8 酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的測(cè)定

1.8.1 酵母菌在YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的測(cè)定 分別將4株酵母菌加到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，使其最終濃度為1×104 cfu/mL，28℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，1 h后開始取樣，每間隔1 h取樣一次，共取樣30次。試驗(yàn)重復(fù)3次。將所測(cè)酵母菌的濃度值轉(zhuǎn)化成其對(duì)數(shù)值。

1.8.2 酵母菌在蘋果果實(shí)傷口上生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的測(cè)定 按照J(rèn)ansiiewicz等[8]的方法測(cè)定4株酵母菌在果實(shí)傷口的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。取30 μL濃度為1×106 cfu/mL酵母菌懸液于果實(shí)傷口中，1 h后測(cè)定的酵母菌濃度為起始值（0 h）。將接種的蘋果放入塑料盒中保濕，方法同1.4.3活體防病試驗(yàn)。測(cè)定酵母菌濃度的方法：用打孔器從傷口處取直徑和深度為4 mm的果肉組織放于研缽內(nèi)研磨，用梯度稀釋平板法記數(shù)。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)3個(gè)果實(shí)。

1.9 酵母菌株的鑒定

1.9.1 形態(tài)觀察 觀察酵母菌在培養(yǎng)基中菌落形態(tài)，在100倍顯微鏡下觀察酵母菌單細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.9.2 分子鑒定 用酵母基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取酵母DNA基因組。采用26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列通用引物擴(kuò)增[9]。引物NL1： 5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，引物NL4： 5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。50 μL反應(yīng)體系：Buffer 5 μL，dNTPS 4 μL，引物NL1（10 μmol/μL）和引物NL4（10 μmol/μL）均為2 μL，Taq酶1 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 32 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min[10， 11]。產(chǎn)物在1%（w/v）瓊脂糖凝膠上電泳40 min，置于凝膠成像儀中檢測(cè)，目標(biāo)條帶經(jīng)切膠回收純化，送至上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與現(xiàn)有的近緣菌株序列比較。用MEGA 6.0軟件以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析供試菌株與已知酵母菌的親緣關(guān)系[12]，確定分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的分離純化結(jié)果

本試驗(yàn)共分離純化得到30株酵母菌，于-20℃甘油中保存。30株酵母菌均分離于果實(shí)和葉片中，土壤中未分離到酵母菌株（表1）。由于果實(shí)和葉片中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和水分，環(huán)境條件更利于酵母菌的生長(zhǎng)和繁殖，所以更易從中分離。

2.2 離體篩選試驗(yàn)結(jié)果

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果顯示，大部分酵母菌對(duì)蘋果輪紋病菌具有一定的拮抗作用，拮抗效果比較好的酵母菌株有H22、H3、H4、H5、PY5、S5、T2、T3、T7、Z5、Z8（表2）。將其用于后續(xù)的活體防病試驗(yàn)。

2.3 活體防病試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果，拮抗效果較好的酵母菌株有H3、T2、T3、Z8。其中Z8的防治效果最好，發(fā)病率只有27.8%，防治效果為84.1%；T2的防治效果次之，為82.5%（表3）。

2.4 不同酵母菌株處理液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

4株酵母菌的菌懸液和培養(yǎng)原液對(duì)病原菌的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，但上清液和高溫處理液對(duì)病原菌的生長(zhǎng)沒有抑制作用（表4），說明培養(yǎng)原液中對(duì)病原菌起抑制作用的是酵母細(xì)胞，而不是酵母細(xì)胞分泌物。2.5 酵母菌對(duì)病原菌的重寄生作用和對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)酵母菌株T3有較多的菌體細(xì)胞吸附于病原菌的菌絲上，表明其對(duì)病原菌菌絲具有重寄生作用，其他3個(gè)菌株沒有明顯的重寄生作用，其抑制病原菌的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。但4株酵母菌都能抑制蘋果果實(shí)輪紋病菌菌絲的生長(zhǎng)，與對(duì)照相比，病原菌菌絲的生長(zhǎng)量明顯降低（圖1，表5）。

2.6 不同濃度酵母菌對(duì)蘋果果實(shí)輪紋病的防治效果

酵母菌濃度越高對(duì)蘋果果實(shí)輪紋病的防治效果越好，其中防治效果最好的是菌株Z8，防治效果為59.4%，而濃度為1×104 cfu/mL時(shí)，防治效果較差（表6）。

2.7 酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的測(cè)定

2.7.1 酵母菌在YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài) 4株酵母菌在YPD培養(yǎng)基中均呈指數(shù)型生長(zhǎng)，24 h時(shí)酵母菌濃度達(dá)到峰值，24 h后酵母菌濃度保持穩(wěn)定（圖2）。

2.7.2 酵母菌在蘋果果實(shí)傷口上的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài) 4株酵母菌均能在蘋果傷口上迅速定殖，48 h后基本達(dá)到濃度峰值，在以后的7 d中，酵母菌能穩(wěn)定定殖在蘋果傷口上，不易受環(huán)境影響，耐受力強(qiáng)（圖3）。

2.8 酵母菌株的鑒定

2.8.1 形態(tài)學(xué)特征 4株酵母菌細(xì)胞均呈橢圓形或圓形，橢圓形細(xì)胞寬度約為2～3 μm，長(zhǎng)度約為4～6 μm，菌落乳白色，光滑濕潤(rùn)，粘稠，容易被挑起。無(wú)性生殖均為出芽生殖，沒有假菌絲（圖4）。

2.8.2 分子鑒定結(jié)果 擴(kuò)增片段大小在500～600 bp（圖5），與文獻(xiàn)資料[13]的數(shù)據(jù)相吻合。根據(jù)特定DNA片段測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析（圖6），結(jié)合Kurtzman 等[14]的研究結(jié)果及形態(tài)特征，將4株酵母菌H3、T2、T3、Z8初步鑒定為季也蒙邁耶氏酵母。

3 討論與結(jié)論

目前，防治果實(shí)采后病害主要使用化學(xué)殺菌劑，雖然化學(xué)殺菌劑高效，但易產(chǎn)生安全和質(zhì)量問題[15]。拮抗酵母菌作為生物防治處理果實(shí)采后病害的方法，具有環(huán)保、安全的特點(diǎn)，可以替代化學(xué)殺菌劑。

蘋果果實(shí)輪紋病是由貝倫格葡萄座腔菌引起的一種重要的蘋果采后病害。目前報(bào)道的生物防治蘋果輪紋病的方法有很多。例如：Fan等[16]用枯草芽孢桿菌9407產(chǎn)生的芬薺素防治蘋果果實(shí)輪紋病具有較好的防病效果，10 d時(shí)防病效果達(dá)57.5%；Gao等[17]用哈茨木霉T88和深綠木霉T95孢子懸浮液田間防治蘋果輪紋病取得良好效果；Chen等[18]用解淀粉芽孢桿菌PG12防治蘋果果實(shí)輪紋病，56 d時(shí)的蘋果果實(shí)輪紋病發(fā)病率為50%，空白對(duì)照的發(fā)病率為100%，高效液相色譜法分析發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌PG12產(chǎn)生的伊枯草菌素A對(duì)蘋果果實(shí)輪紋病的防治具有重要作用。酵母菌防治蘋果輪紋病的報(bào)道很少，本試驗(yàn)結(jié)果表明，從果實(shí)和葉片中分離純化出的酵母菌株H3、T2、T3、Z8在離體篩選與活體防病試驗(yàn)中都具有明顯的拮抗效果，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)初步鑒定，4株酵母菌均為季也蒙邁耶氏酵母[過去名稱是季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）]，目前尚未有關(guān)于季也蒙邁耶氏（畢赤）酵母防治蘋果果實(shí)輪紋病的報(bào)道。

果實(shí)表面和傷口中營(yíng)養(yǎng)豐富，水分充足，有利于酵母菌的定殖，30株酵母菌大多分離于果實(shí)表面和傷口處，其中具有拮抗作用的4株酵母菌均能迅速定殖于蘋果傷口處，48 h后酵母菌濃度達(dá)到峰值，并能穩(wěn)定存活在蘋果傷口處，與宋聰[19]研究結(jié)果一致：酵母菌在培養(yǎng)初期的48 h，前12 h內(nèi)迅速生長(zhǎng)，48 h時(shí)達(dá)到最高值，此后，數(shù)量基本維持在較高水平。酵母菌的接種濃度為1×108 cfu/mL時(shí)活體防病效果顯著高于濃度為1×104 cfu/mL，酵母菌濃度越高，活體防病效果越好。

綜上所述，本試驗(yàn)篩選出的4株季也蒙邁耶氏酵母菌H3、T2、T3、Z8能夠在蘋果果實(shí)上穩(wěn)定定殖，并對(duì)蘋果果實(shí)輪紋病表現(xiàn)出較好的防病效果，為生防酵母菌在防治果蔬采后病害中的應(yīng)用提供了依據(jù)，但其抑菌防病機(jī)理和如何提高防病效果尚需進(jìn)一步研究。

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