基于時間序列轉(zhuǎn)錄組篩選谷氨酸棒桿菌內(nèi)源高效組成型啟動子

王迎春，劉嬌，倪曉蒙，雷宇，鄭平，刁愛坡

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基于時間序列轉(zhuǎn)錄組篩選谷氨酸棒桿菌內(nèi)源高效組成型啟動子

王迎春1,2,3，劉嬌2,3，倪曉蒙2,3，雷宇3，鄭平2,3，刁愛坡1

1 天津科技大學 生物工程學院，天津 300457 2 中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308 3 中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

王迎春, 劉嬌, 倪曉蒙, 等. 基于時間序列轉(zhuǎn)錄組篩選谷氨酸棒桿菌內(nèi)源高效組成型啟動子. 生物工程學報, 2018, 34(11): 1760–1771.Wang YC, Liu J, Ni XM, et al. Screening efficient constitutive promoters in Corynebacterium glutamicum based on time-series transcriptome analysis. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1760–1771.

啟動子是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，廣泛用于工業(yè)菌株的代謝工程改造。谷氨酸棒桿菌是重要的氨基酸生產(chǎn)菌株，但已報道的組成型強啟動子較少。對谷氨酸高產(chǎn)菌SL4發(fā)酵過程的10個時間點樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選在發(fā)酵過程中穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄并且轉(zhuǎn)錄水平最高的10個基因；分別克隆其啟動子序列至紅色熒光蛋白 (RFP) 報告系統(tǒng)，通過熒光強度表征啟動子在SL4菌株中的強度，再在野生型ATCC 13869和ATCC 13032中驗證部分啟動子的通用性；并采用LacZ蛋白進一步評價強啟動子的表達效果。結(jié)果顯示，成功篩選到3個可以通用的組成型啟動子P、P和P。其中P的表達強度最高，與誘導型強啟動子P對比，在SL4和13869菌株中均達到其2倍 (RFP) 和4倍 (LacZ) 以上；在ATCC 13032菌株中，P的表達強度為P的0.3?0.4倍。P首次被報道為強啟動子，可用于谷氨酸棒桿菌強化合成途徑的代謝工程改造。

谷氨酸棒桿菌，時間序列轉(zhuǎn)錄組，啟動子，RFP報告系統(tǒng)

谷氨酸棒桿菌是重要的氨基酸工業(yè)生產(chǎn)菌株，主要用于生產(chǎn)L-谷氨酸、L-賴氨酸和L-異亮氨酸等氨基酸[1]。谷氨酸棒桿菌可以適應(yīng)簡單原料和復雜環(huán)境，耐受高濃度碳源[2]，并已被美國FDA認證為安全(Generally recognized as safe，GRAS) 的微生物[3]，近年來又被廣泛用于生產(chǎn)生物乙醇和異丁醇等生物燃料[4-6]、琥珀酸和乳酸等有機酸、二元胺和聚羥基丁酸脂等生物材料單體[7-9]以及重組蛋白等生物大分子[10]。代謝工程強化目標產(chǎn)物的合成途徑是提升工業(yè)菌株性能的常用策略，其中利用強啟動子構(gòu)建高效的轉(zhuǎn)錄表達盒已經(jīng)被證明是非常有效的手段[3,11–12]。

谷氨酸棒桿菌中關(guān)于誘導型啟動子的研究較多，例如已經(jīng)成功地構(gòu)建了IPTG (Isopropyl- β-dthiogalactopyranoside)誘導型、麥芽糖誘導型、葡萄糖酸誘導型、阿拉伯糖誘導型、鼠李糖誘導型、乙酸誘導型、四環(huán)素誘導型和丙酸誘導型等誘導型啟動子[13–16]。在代謝工程改造中，誘導型啟動子可以通過改變誘導劑濃度實現(xiàn)不同強度表達，使用最多的是IPTG誘導啟動子，如P和P。然而由于其需要添加誘導劑，近年來谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造更傾向使用組成型啟動子。常用的內(nèi)源組成型啟動子包括P、P、P和P。Tateno等[17]和Vogt等[18]利用P啟動子分別提高L-賴氨酸和L-異亮氨酸的產(chǎn)量。Park等[19]和Kim等[20]利用P啟動子分別提高L-精氨酸和L-鳥氨酸的產(chǎn)量。Park等[19]和Jensen等[21]利用P啟動子分別提高L-精氨酸和L-谷氨酸衍生物的產(chǎn)量。隨著合成生物學的發(fā)展，研究者開始發(fā)展人工合成啟動子。Yim等[22]通過人工合成完全隨機的70 bp序列，再基于GFP篩選了系列強度啟動子，并且應(yīng)用于木聚糖內(nèi)切酶等的分泌生產(chǎn)。Rytter等[23]基于谷氨酸棒桿菌啟動子–10區(qū)共有序列和大腸桿菌啟動子–35區(qū)共有序列設(shè)計并篩選了人工啟動子。

目前已經(jīng)表征的組成型啟動子的表達強度大多低于完全誘導的P等啟動子。Ravasi等[24]用GFP作為報告系統(tǒng)進行比較，結(jié)果顯示P和P啟動子的表達強度分別約為P的0.5和0.1倍。Shang等[25]用LacZ作為報告系統(tǒng)表征部分內(nèi)源啟動子，結(jié)果顯示P和P啟動子的表達強度分別約為P的0.7倍和0.3倍，只有P啟動子的表達強度比P高，約為P的1.35倍。因此依然需要挖掘更多高表達強度的組成型啟動子。

轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學可以系統(tǒng)地表征基因的表達水平，近年來已經(jīng)被用于篩選啟動子元件。Zhao等[26]從谷氨酸棒桿菌蛋白組數(shù)據(jù)中顯示高蛋白表達的12個基因中篩選到強組成型啟動子P。蛋白組數(shù)據(jù)只能間接反映基因的轉(zhuǎn)錄水平，直接反映基因轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)更有利于篩選高表達強度的啟動子。劉秀霞等[27]通過分析谷氨酸棒桿菌高、中、低溶氧條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從不同條件下均高轉(zhuǎn)錄的6個候選基因中篩選到組成型強啟動子P。本研究基于谷氨酸高產(chǎn)菌SL4發(fā)酵過程的時間序列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選發(fā)酵過程均穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄水平最高的10個基因；通過紅色熒光蛋白(RFP) 報告系統(tǒng)在SL4菌株中表征這些基因的啟動子強度，并采用野生型菌株和LacZ蛋白進一步驗證部分啟動子的通用性。最終獲得了3個通用的組成型啟動子，其中P首次被報道為強啟動子，這些啟動子均可用于谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用菌株與質(zhì)粒

1.1.2 引物設(shè)計與合成

本研究所用引物使用Vector軟件設(shè)計，引物名稱及序列如表2所示，引物均由蘇州金唯智公司合成。

1.1.3 主要試劑與儀器

質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購自北京TIANGEN公司；基因組提取試劑盒購自美國Biomiga公司；RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit) 購自QIAGEN公司；重組克隆試劑盒(ClonExpress?CE II) 購自南京Vazyme公司；酵母粉和蛋白胨購自英國Oxoid公司；卡那霉素等抗生素購自北京Solarbio公司；其余所有試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR熱循環(huán)儀，Applied Biosystems公司；分光光度計，Shimadzu公司；Nanodro超微量核酸蛋白測定儀，Thermo Scietific公司；電擊轉(zhuǎn)化儀，Mettler Toledo公司；DM5000B熒光顯微鏡，Leica公司；SpectraMaxM5多功能連續(xù)酶標儀，Molecular Devices公司；Illumina MiSeq平臺，Illumina公司。

表2 本研究所用引物

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g/L NaCl，10 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母粉，根據(jù)需要添加50 μg/mL卡那霉素，用于培養(yǎng)。LBG培養(yǎng)基：10 g/L NaCl，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，5 g/L葡萄糖，根據(jù)需要添加25 μg/mL卡那霉素，用于ATCC 13869和ATCC 13032培養(yǎng)。SGY培養(yǎng)基：5 g/L 葡萄糖，10 g/L酵母粉，18 g/L大豆蛋白胨，1 g/L K2HPO4·3H2O，10 g/L 尿素，0.5 g/L 丁二酸，10 μg/L生物素，pH調(diào)至7.1，根據(jù)需要添加25 μg/mL卡那霉素，用于SL4培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建基于RFP的啟動子報告系統(tǒng)

以pEC-XK99E質(zhì)粒為模板，以pEC-XK99E-F和pEC-XK99E-R為引物反向擴增得到線性化載體pEC-XK99E。以pSB4K5-質(zhì)粒為模板，以-F和-R為引物擴增得到攜帶RBS序列的片段。由于引物-F和-R攜帶用于重組克隆的同源臂，使用重組克隆試劑盒，將擴增得到的片段與線性化載體pEC-XK99E進行重組連接，獲得重組質(zhì)粒pEC-XK99E-。采用100倍油鏡在綠色激發(fā)光下顯微鏡觀察熒光。

1.2.2SL4菌株的時間序列轉(zhuǎn)錄組測序及目標基因篩選

實驗室前期在5 L發(fā)酵罐，采用溫敏工藝(以葡萄糖為碳源，玉米漿、大豆蛋白胨和氨水調(diào)pH提供氮源，生物素充足) 分批補料發(fā)酵SL4菌株生產(chǎn)谷氨酸，初期發(fā)酵溫度為33 ℃，8 h開始升溫至36.5 ℃，其后逐漸升溫至39.5 ℃，發(fā)酵周期28 h。本研究直接從發(fā)酵罐中取樣，取樣時間分別為1、3、5.5、8、9.5、11.5、13.5、15.5、18.5、23.5 h，菌體4 ℃離心快速收集，液氮速凍并保存于–80 ℃。液氮研磨菌體成粉末狀，再采用QIAGEN RNeasy Mini Kit試劑盒進行RNA的提取及純化。RNA樣品送中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所技術(shù)支撐中心，在Illumina MiSeq平臺上進行建庫及雙端150 bp測序，每個樣品獲得約1.5 G原始數(shù)據(jù)。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量過濾后，利用Samtools和HTSeq軟件計算每個樣本中每個基因的count值(每個基因比對上的reads數(shù))，通過Python腳本和FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 公式計算每個樣本中每個基因的FPKM值。計算每個基因10個時間點的FPKM平均值，根據(jù)(每個時間點的FPKM值?平均值)/平均值計算每個點的波動，篩選8個以上時間點的上下波動不超過平均值50%的基因(由于10個點波動都不超過50%會去掉大量高轉(zhuǎn)錄水平的基因)，再選擇FPKM平均值最高的10個基因。

1.2.3 啟動子的克隆及其RFP報告質(zhì)粒的構(gòu)建

基因的啟動子序列由查閱文獻分析比對菌株SL4的基因序列獲得，選擇全部上游非編碼區(qū)作為其啟動子序列，所有啟動子表征時使用相同的5?-UTR和SD序列(下劃線)：5?-GAGCGGATAACAATTTCACACAGGC CTTGAGAATG-3?，ATG(加粗)為起始密碼子。以SL4菌株的基因組為模板，采用相應(yīng)的引物(表2) 擴增10個啟動子片段。以pXMJ19質(zhì)粒為模板，采用P-F和P-R引物擴增P啟動子片段。以pEC-XK99E-質(zhì)粒為模板，以△-F和△-R為引物反向擴增去除質(zhì)粒中的P，獲得線性化載體片段。使用重組克隆試劑盒，將啟動子片段與線性化載體片段分別進行重組連接，獲得含有不同啟動子的11個報告質(zhì)粒。所有報告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化SL4、ATCC 13869和ATCC 13032菌株，獲得表達熒光蛋白的重組菌。

1.2.4600和熒光值的測定

挑取平板活化的單克隆接入含20 mL SGY或LBG培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，30 ℃、220 r/min條件下過夜培養(yǎng)，取適量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入含30 mL SGY或LBG培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，使得初始600為0.5，在同樣的條件下培養(yǎng)，每隔2?4 h取樣檢測600和熒光強度。每個樣品3個平行。包含P和P啟動子的對照菌株在接種時添加0.5 mmol/L IPTG。600稀釋至合適濃度在酶標儀上測定。熒光強度測定，先用PBS緩沖液洗滌菌體2次，再稀釋至合適濃度，在多功能連續(xù)酶標 儀上分別測定600和熒光值，激發(fā)波長為560 nm，發(fā)射波長為607 nm，熒光強度為測定的熒光 值/600。

1.2.5 LacZ表達質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建及β-半乳糖苷酶活性的測定

分別以pEC-XK99E-、pWYC-11和pWYC-5質(zhì)粒為模板，以△-F和△-R為引物反向擴增獲得各質(zhì)粒去除的質(zhì)粒骨架；以質(zhì)粒pZSP1為模板，以-F和-R為引物擴增得到片段。采用一步重組克隆試劑盒，將擴增得到的段與對應(yīng)的質(zhì)粒骨架進行重組連接，分別獲得pEC-XK99E-、pWYC-12和pWYC-13重組質(zhì)粒。所有質(zhì)粒使用相同的5?-UTR和SD序列(下劃線)：5?-GAGCGGATAACAATTTCACACAG GCCCACACCAGCTATG-3?，ATG(加粗)為起始密碼子。所有重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至3株谷氨酸棒桿菌中。

檢測β-半乳糖苷酶活性：菌株培養(yǎng)與熒光測定相同，每個樣品設(shè)定3個平行。取適量穩(wěn)定期菌液冰上孵育20 min，再取0.5 mL 菌液于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，用0.5 mL預(yù)冷的Z緩沖液(0.06 mol/L Na2HPO4·7H2O、0.04 mol/L NaH2PO4·H2O、0.01 mol/L KCl、0.001 mol/L MgSO4、0.05 mol/L β-巰基乙醇，pH 7.0) 重懸細胞，測定600。取0.1 mL上述樣品加入100 μL 氯仿和50 μL 0.1% SDS，振蕩混勻，30 ℃孵育 1 h。加入0.2 mL 30 ℃預(yù)熱的反應(yīng)底物ONPG (4 mg/mL)，混勻并開始計時，30 ℃孵育一定時間。當反應(yīng)液充分變?yōu)辄S色后，加入0.5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液，振蕩混勻，同時記錄時間。在酶 標儀中測定420和550的數(shù)值，通過以下公式計算酶活：Miller Units=1000×(420–1.75×550)/ (600×菌液體積(mL)×反應(yīng)時間(min))。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建基于RFP的啟動子報告系統(tǒng)

以作為報告基因，根據(jù)1.2.1所描述的方法，在大腸桿菌DH5α中構(gòu)建pEC-XK99E-質(zhì)粒(圖1)，轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗證和質(zhì)粒測序都正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將pEC-XK99E-質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至SL4中，獲得SL4 (pEC-XK99E-) 菌株，熒光顯微鏡觀察顯示其可以表達紅色熒光蛋白(圖2)，表明RFP報告系統(tǒng)構(gòu)建成功。

圖1 pEC-XK99E-rfp質(zhì)粒圖譜

圖2 C. glutamicum SL4 (pEC-XK99E-rfp) 菌株的熒光顯微鏡觀察

2.2 C. glutamicum SL4菌株發(fā)酵過程的轉(zhuǎn)錄組測序及目標基因的篩選

根據(jù)1.2.2描述的方法，進行SL4菌株發(fā)酵過程10個時間點樣品的轉(zhuǎn)錄組測序，并通過組學數(shù)據(jù)分析篩選候選基因。取樣時間包括菌體生長和產(chǎn)酸的各個時期，可以全面地分析該菌株發(fā)酵過程的基因轉(zhuǎn)錄水平。由于常規(guī)谷氨酸棒桿菌RNA提取方法中的溶菌酶處理過程會改變胞內(nèi)真實的RNA水平，本研究采用液氮研磨法提取10個樣品的總RNA，所有樣品的RNA濃度和完整性都可以達到測序要求。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析，篩選出發(fā)酵過程均穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄水平最高的10個基因，其發(fā)酵過程的轉(zhuǎn)錄水平如圖3所示，F(xiàn)PKM平均值及基因功能等如 表3所示，其中和基因的整體轉(zhuǎn)錄水平更高，其他8個基因轉(zhuǎn)錄水平差異較小。

圖3 10個目標基因在發(fā)酵過程中的轉(zhuǎn)錄水平

表3 10個目標基因的功能、FPKM平均值和啟動子長度

2.3 C. glutamicum SL4菌株中表征啟動子的強度

按照方法1.2.3成功構(gòu)建含不同啟動子的報告質(zhì)粒。將含有不同啟動子表達RFP的SL4重組菌接入培養(yǎng)基中，按照1.2.4中的方法進行培養(yǎng)，并使用多功能酶標儀分別檢測600和熒光強度，以穩(wěn)定期35 h的熒光強度表征啟動子強度。重組菌的生長情況如圖4A和4C所示，與空質(zhì)粒、P和P對照相比，所有菌的生長無明顯差別，都在12 h即可達到穩(wěn)定期，600約為6，說明這些啟動子表達RFP不影響菌株生長。熒光強度檢測結(jié)果如圖4B和4D所示，前12 h所有啟動子的熒光強度都較低，在12–23 h期間熒光強度逐漸增強，培養(yǎng)至23 h時基本達到最高，其后保持穩(wěn)定。IPTG誘導型對照啟動子P和P的強度和表達模式都基本一致，為了同文獻對比，以P啟動子的強度進行比較。P、P和P啟動子為表達強度最高的3個組成型啟動子(圖4B)，其強度順序為P>P>P，分別達到(1 190±31)、(163±3) 和(110±4) RFU/600，其強度分別為P的2.2、0.3和0.2倍；其余7個啟動子的表達強度都更低。

圖4 不同啟動子表達RFP的C. glutamicum SL4系列重組菌的生長曲線及熒光強度

2.4 野生型谷氨酸棒桿菌中表征啟動子強度

為了評價3個啟動子P、P和P的通用性，將含有這3個啟動子的報告質(zhì)粒及對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入野生型ATCC 13869和ATCC 13032，并采用更通用的LBG培養(yǎng)基培養(yǎng)，以穩(wěn)定期23 h的熒光強度表征啟動子強度。與對照菌株相比，不同啟動子表達RFP的ATCC 13869和ATCC 13032重組菌的生長無明顯差別，說明在這2個菌株中不同啟動子表達RFP均不影響菌株的生長。熒光強度檢測結(jié)果如圖5所示，P和P的強度和表達模式也基本一致，同樣以P啟動子的強度進行比較，在ATCC 13869菌株中，P、P和P啟動子強度分別達到 (1 075±21)、(98±5) 和(72±5)RFU/600，強度及順序與在SL4菌株中類似，其強度分別是P的2.1、0.2和0.1倍；在ATCC 13032菌株中，P、P和P啟動子強度分別達到(154±2)、(77±6)和(48±6)RFU/600，強度順序與在SL4和ATCC 13869菌株中類似，其中P和P啟動子強度變化較小，分別為P的0.2倍和 0.1倍；但P啟動子強度明顯下降，只有P的0.3倍。

2.5 PcysK啟動子用于LacZ蛋白表達

為了進一步評價強啟動子P的蛋白表達效果，分別在SL4、ATCC 13869和ATCC 13032菌株中驗證其表達LacZ的效果，并以P和P啟動子為對照。測定蛋白表達穩(wěn)定期的β-半乳糖苷酶活性，結(jié)果如圖6所示，P和P啟動子在3株菌中的表達效果相似，也以P進行比較，在SL4和ATCC 13869菌株中，P啟動子表達的LacZ活性分別約為P的4.1和 4.3倍；在ATCC 13032菌株中，P啟動子表達的LacZ活性約為P的0.4倍。以上結(jié)果表明，P啟動子表達LacZ的趨勢與RFP一致，但在SL4和ATCC 13869菌株中可以更加高效地表達LacZ。

圖5 PcysK、PgapA和PfumC啟動子表達RFP的C. glutamicum ATCC13869和ATCC 13032系列重組菌的熒光強度

圖6 PcysK啟動子在C. glutamicum SL4、ATCC 13869和ATCC 13032菌株中表達LacZ

3 討論

隨著谷氨酸棒桿菌在現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中被越來越多地用于生產(chǎn)更多產(chǎn)品，需要挖掘更多的表達元件用于遺傳育種改造，從而實現(xiàn)高效生產(chǎn)不同目標產(chǎn)物[10,30]。相比于誘導型啟動子，高效的組成型啟動子逐漸展現(xiàn)出優(yōu)勢[31–33]。本研究 采用RFP報告系統(tǒng)，從發(fā)酵過程均高水平轉(zhuǎn)錄的10個基因中篩選到3個內(nèi)源組成型啟動子，其中P啟動子首次被報道為強啟動子，為谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造提供了新的表達元件。

多種條件或多個時間點的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以反映每個基因的轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄模式，從而可以幫助篩選所需類型的啟動子元件。本研究基于發(fā)酵過程的時間序列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選的10個發(fā)酵過程均高水平轉(zhuǎn)錄的基因，與劉秀霞等[27]通過分析不同溶氧條件轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選的6個不同溶氧條件均高水平轉(zhuǎn)錄的基因相比，只有基因是共有的，其基于EGFP報告系統(tǒng)表征P啟動子為強啟動子，而在本研究中采用RFP報告系統(tǒng)表征發(fā)現(xiàn)P的強度很低。與其相比，本研究選取的P啟動子長度更長。Ravasi等[24]發(fā)現(xiàn)不同報告基因?qū)ο嗤瑔幼拥脑u價結(jié)果也存在較大差異。因此我們認為啟動子序列、報告基因、菌株和培養(yǎng)條件的差異是造成P啟動子表征結(jié)果不同的主要原因。此前報道的組成型啟動子P和P，其起始轉(zhuǎn)錄的基因在發(fā)酵過程中均可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，但平均轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有排在前10位，因此沒有入選。另外，本研究中多個基因基于RFP報告系統(tǒng)表征的啟動子強度與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄水平FPKM值并不一致，該現(xiàn)象在其他已報道的類似研究中同樣存在。在原核生物中啟動子是影響基因轉(zhuǎn)錄水平的主要因素，因此一般來說，以全基因組規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選內(nèi)源啟動子是一種可行的初篩方法。但是由于基因的轉(zhuǎn)錄水平也受基因序列(包括報告基因)、基因的拷貝數(shù)、DNA的二級結(jié)構(gòu)、mRNA的穩(wěn)定性和基因轉(zhuǎn)錄的外部環(huán)境條件等的影響，所以高轉(zhuǎn)錄水平的基因不一定都能通過報告系統(tǒng)表征出強啟動子。蛋白質(zhì)的表達水平還與5?-UTR、SD序列、mRNA的二級結(jié)構(gòu)和密碼子使用頻率等相關(guān)，所以當采用相同的5?-UTR、SD序列和報告基因表征不同啟動子時，可以通過RFP等報告蛋白的表達量來表征不同啟動子在相同條件的強度，但是如果以上因素發(fā)生變化時，啟動子強度也可能不同。由此可見，以上因素都可能導致報告系統(tǒng)表征的啟動子強度與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄水平不一致，研究者在使用相關(guān)結(jié)果時應(yīng)當全面慎重評估。

為驗證本研究發(fā)現(xiàn)的3個內(nèi)源組成啟動子的普適性，又分別在ATCC 13869和ATCC 13032菌株中進行了表征和效果評價。在SL4和ATCC 13869菌株中，P啟動子強度約為IPTG誘導型啟動子P的2.2倍；在ATCC 13032菌株中，其強度約為P的0.3倍，其在3株菌中表達LacZ的效果與RFP趨勢一致，該啟動子的表達強度受菌株影響較大，因此在不同的谷氨酸棒桿菌菌株中使用時需要注意此點。P和P啟動子的強度在3株菌中差異較小，約為P的0.1?0.3倍，其受菌株影響較小。根據(jù)Shang等[25]建議的內(nèi)源組成型強啟動子標準，將表達強度大于等于P的0.3倍劃分為強啟動子，而小于0.3倍為弱啟動子。由此可見，P為強啟動子，P和P為弱啟動子。

4 結(jié)論

本研究基于谷氨酸高產(chǎn)菌SL4的時間序列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從發(fā)酵過程均高水平轉(zhuǎn)錄的基因篩選內(nèi)源的組成型強啟動子，通過RFP報告系統(tǒng)表征了10個候選啟動子，成功獲得3個可以通用的組成型啟動子P、P和P。其中P的表達強度最高，也可以高效表達LacZ蛋白，該啟動子首次被報道為強啟動子，可作為高效元件用于谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造。

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Screening efficient constitutive promoters inbased on time-series transcriptome analysis

Yingchun Wang1,2,3, Jiao Liu2,3, Xiaomeng Ni2,3, Yu Lei3, Ping Zheng2,3, and Aipo Diao1

1 School of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China 2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Promoter, an essential regulatory element, is widely used for metabolic engineering of industrial strains.is an important industrial workhorse to produce various amino acids. However, strong constitutive promoters that are applicable toare rarely reported. In this study, we first performed a time-series transcriptome analysis of a glutamate hyper-producingstrainSL4 by using RNA-Seq. Overall, we picked 10 samples at different time during the fermentation process. By analyzing the time-series transcriptome data, we selected 10 candidate genes with the highest transcriptional level. These genes were all transcribed stably during the fermentation process. We subsequently cloned the promoter sequences and evaluated the promoters’ strength in strain SL4 using a red fluorescent protein reporter system. To evaluate the universality of the promoters in differentstrains, we further tested the performance of some promoters in wild typestrains, including ATCC 13869 and ATCC 13032. The strongest promoter was further characterized using LacZ as a reporter in all the threestrains. Finally, we successfully obtained three constitutive promoters with universality, P, Pand P. Pis the most efficient promoter among the threestrains. In strains SL4 and ATCC 13869, the strength of Pis 2-fold of the strong inducible promoter Pusing the red fluorescent protein as a reporter and 4-fold of Pusing LacZ as a reporter. Moreover, the strength of Preaches 30%?40% of Pin strain ATCC 13032. The promoter Pis identified as a strong promoter for the first time, which can be used as an efficient biobrick for metabolic engineering of synthesis pathways in.

, time-series transcriptome, promoter, red fluorescent protein reporter system

January 29, 2018;

April 26, 2018

Tianjin Science and Technology Program (Nos. 15PTCYSY00020, 14ZCZDSY00058), Tianjin Municipal City, the First “Special Support Plan for Talents Development” and “High-level Innovation and Entrepreneurship Team”, National Natural Science Foundation of China (No. 31700044).

Ping Zheng. Tel/Fax: +86-22-84861943; E-mail: zheng_p@tib.cas.cn

Aipo Diao. Tel/Fax: +86-22-60602948; E-mail: diaoaipo@tust.edu.cn

10.13345/j.cjb.180041

天津市科技計劃項目 (Nos. 15PTCYSY00020，14ZCZDSY00058)，天津市特支計劃高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團隊，國家自然科學基金 (No. 31700044) 資助。

(本文責編 陳宏宇)