壩上長(zhǎng)尾雞pmel基因核心啟動(dòng)子的鑒定

劉小輝，周榮艷，彭永東，張傳生，李蘭會(huì)，李祥龍,

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壩上長(zhǎng)尾雞基因核心啟動(dòng)子的鑒定

劉小輝1，周榮艷1，彭永東2，張傳生2，李蘭會(huì)1，李祥龍1,2

1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001 2 河北科技師范學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066004

劉小輝, 周榮艷, 彭永東, 等. 壩上長(zhǎng)尾雞pmel基因核心啟動(dòng)子的鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(11): 1750–1759.Liu XH, Zhou RY, Peng YD, et al. Identification of the core promoter of the pmel gene of Bashang long-tail chickens. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1750–1759.

為探明壩上長(zhǎng)尾雞的前黑素小體蛋白 (Pre-melanosomal protein，Pmel) 基因核心啟動(dòng)子區(qū)，首先構(gòu)建了雙熒光素酶表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞DF1，并利用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行啟動(dòng)活性檢測(cè)。成功克隆了壩上長(zhǎng)尾雞基因5￠側(cè)翼區(qū)片段1 268 bp，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū) (?1 200–+68) 含有2個(gè)CpG島和多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建了9個(gè)含有不同長(zhǎng)度基因啟動(dòng)子片段的表達(dá)載體及1個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)突變載體，說(shuō)明雞基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域?yàn)?840–+68 bp，其中?840–?590 bp和?525–?266 bp區(qū)域?yàn)檎{(diào)控區(qū)，?590–?525 bp區(qū)域?yàn)樨?fù)調(diào)控區(qū)，多態(tài)位點(diǎn) (?456、?435、?410、?374和?341) 對(duì)基因啟動(dòng)子活性有較大 影響。

壩上長(zhǎng)尾雞，基因，啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄因子

禽羽毛是反映品種和性別的重要表型器官之一，羽毛色澤、形態(tài)等外觀性狀是定價(jià)的重要參考指標(biāo)，羽色的多樣性也是自身的天然保護(hù)色，壩上長(zhǎng)尾雞就含有多種羽色，包括白、黑、麻、蘆花、銀、山水等。毛色的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不同的表型由一系列毛色基因控制，前人已發(fā)現(xiàn)并分析了一些與毛色相關(guān)的變異位點(diǎn)，目前小鼠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)378個(gè)與毛色相關(guān)的基因位點(diǎn)[1]。每一個(gè)毛色相關(guān)基因都會(huì)單獨(dú)或與其他基因一起對(duì)一到多個(gè)色素性狀起作用[2]。而黑色表型的形成離不開(kāi)黑色素的沉積，黑色素是由黑色素細(xì)胞生成的，黑素體是色素細(xì)胞中的膜結(jié)合細(xì)胞器，合成并儲(chǔ)存色素，黑素體是研究細(xì)胞膜活動(dòng)分子機(jī)制的完美模型[3-5]。黑色素的形成和沉積主要發(fā)生在黑素小體的淀粉樣纖維上，前黑素小體蛋白與黑色素的產(chǎn)生和沉積關(guān)系緊密，在黑色素的合成和貯存中發(fā)揮重要作用[6]。已有研究報(bào)道，在高原牛中，突變使得真黑素和褐黑素均受到影響[7]?；虻耐蛔儠?huì)引起馬的銀色表型[8-9]，雞羽色呈煙灰色或白色[10]。小鼠失活時(shí)黑素體會(huì)變成球形，而野生型小鼠黑素體是橢圓形，失活引起毛發(fā)中真黑素大量減少，在維持表皮色素沉積上有重要作用，但對(duì)小鼠毛色表型僅有輕微影響[11]。雞基因位于33號(hào)染色體(GenBank登錄號(hào)：NC_008465.3)，含有11個(gè)外顯子，長(zhǎng)約4 kb，編碼740個(gè)氨基酸(數(shù)據(jù)庫(kù)：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

啟動(dòng)子區(qū)決定轉(zhuǎn)錄起始，調(diào)控基因表達(dá)的強(qiáng)弱，研究基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有非常重要的作用。關(guān)于山羊和水貂的啟動(dòng)子已有研究，并且證明Sp1是其重要的正調(diào)控元件[12-13]。本研究通過(guò)雞基因啟動(dòng)子活性分析，以明確該基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)及候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，為研究雞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)用壩上長(zhǎng)尾雞的血液樣品來(lái)源于張家口京星園生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，采集60周齡壩上長(zhǎng)尾雞的黑羽母雞翅根部靜脈血，共采集53個(gè)樣本。

1.2 試驗(yàn)試劑

基因組提取試劑盒、酶、PCR純化試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、Trans5α感受態(tài)、染色劑、胎牛血清購(gòu)自北京全式金公司。pMD19-T (Simple)、DNA連接試劑盒、Ⅰ和dⅢ購(gòu)自寶生物工程(大連) 有限公司。DNA小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海) 股份有限公司。無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。DMEM、DPBS (Hyclone，美國(guó))，T4 DNA連接酶、0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM培養(yǎng)基和Lipofectamine?2000 (Thermo Fisher Science，美國(guó))，pGL3-Basic質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒(平皓生物技術(shù)有限公司，中國(guó)北京)，雞成纖維細(xì)胞(DF1) (北京協(xié)和細(xì)胞資源庫(kù)，中國(guó)北京)。

1.3 方法

1.3.1 啟動(dòng)子序列分析

通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu/)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、BioEdit7.0.9分析序列，用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物分析限制性酶切位點(diǎn)，通過(guò)AliBaba2.1數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/ index.html) 預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，用MethPrimer軟件(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/ methprimer.cgi) 預(yù)測(cè)CpG島。

1.3.2 PCR擴(kuò)增和載體構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取雞基因上游序列(GenBank登錄號(hào)：NC_008465.3) 2 000 bp，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，分析限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引入Ⅰ和dⅢ，并加上保護(hù)堿基，擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的缺失片段(表1)。PCR擴(kuò)增體系：酶0.5 μL，緩沖液5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，DNA (50 ng/μL) 5 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃延伸，共35個(gè)循環(huán)(退火溫度和延伸時(shí)間見(jiàn)表1)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化，與pMD19-T (Simple) 重組，分別對(duì)重組T載體和pGL3-Basic雙酶切，回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接，將重組的表達(dá)載體P1轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細(xì)胞。再以P1為模板依次構(gòu)建P2–P9，對(duì)酶切和測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的菌液提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒并檢測(cè)其濃度和純度。

1.3.3 啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)檢測(cè)和突變載體的構(gòu)建

從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)公布的數(shù)據(jù)可以看出啟動(dòng)子區(qū)存在單核苷酸多態(tài)(Single nucleotide polymorphisms，SNPs) (圖1)，以53只壩上長(zhǎng)尾雞DNA為模板，利用核心啟動(dòng)子區(qū)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并送至北京六合華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，分析序列多態(tài)位點(diǎn)。

選擇核心啟動(dòng)子區(qū)要獲得的多態(tài)位點(diǎn)與已獲得的核心啟動(dòng)子表達(dá)載體該位點(diǎn)堿基不同或?yàn)殡s合的PCR產(chǎn)物，按照以上載體構(gòu)建的方法，構(gòu)建核心啟動(dòng)子區(qū)突變載體并進(jìn)行測(cè)序，挑選符合要求的載體，提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒并檢測(cè)其濃度和純度。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)和活性檢測(cè)

DF1細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行，DMEM含10%胎牛血清，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)鋪于24孔板內(nèi)，24 h細(xì)胞貼壁覆蓋底部80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔表達(dá)載體(0.475 μg)、pRL-TK (0.025 μg)、脂質(zhì)體(1.0 μL) 和Opti-MEM共50 μL混勻孵育5 min，轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞，48 h檢測(cè)螢火蟲(chóng)與海腎熒光素酶的相對(duì)活性。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次系統(tǒng)重復(fù)，每次包含3次技術(shù)重復(fù)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

Note: Bold types (GG and CC) are protective bases, and underlined sequences (GGTACC and CAAGCTT) are restriction enzyme cutting sites, F represents forward primer, R represents reverse primer.

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

將測(cè)得螢火蟲(chóng)熒光素酶活性檢測(cè)值F除以海腎熒光素酶活性檢測(cè)值R，得到相對(duì)值F/R，再除以對(duì)照pGL3-Basic的相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)的背景值，以消除不同轉(zhuǎn)染批次的系統(tǒng)誤差。利用SPSS19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Kruskal-Wallis H(K)非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 壩上長(zhǎng)尾雞pmel基因啟動(dòng)子擴(kuò)增與序列分析

以壩上長(zhǎng)尾雞基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得了雞基因候選啟動(dòng)子區(qū)域1 268 bp，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，與UCSC提交的基因序列(Chromosome 33: 616 856–618 124) 相似性為99.2% (圖1)，說(shuō)明片段來(lái)源正確，可用于試驗(yàn)，將此處外顯子1起始位點(diǎn)作為+1。發(fā)現(xiàn)該基因的?1 152–?483 bp和?150–+12 bp處分別存在670 bp和162 bp的CpG島(圖2)。啟動(dòng)子區(qū)(?840–?266) 預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：Sp1、AP-2、YY1、GATA-1、NF-κB、USF、SRF、Oct-1、C/EBP、CREB、RAP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。Sp1在?840–?793 bp和?403–?266 bp區(qū)域分布最為集中，?793–?590 bp區(qū)域較為集中，?590–?403 bp區(qū)域最少。

2.2 壩上長(zhǎng)尾雞pmel啟動(dòng)子區(qū)不同缺失片段的擴(kuò)增

利用不同引物對(duì)雞基因候選啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行缺失片段的擴(kuò)增，包括p1 (?1 200–+68)、 p2 (?840–+68)、p3 (?793–+68)、p4 (?639–+68)、p5 (?590–+68)、p6 (?545–+68)、p7 (?525–+68)、p8 (?403–+68)、p9 (?266–+68)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，缺失片段長(zhǎng)度與預(yù)期一致。

圖1 壩上長(zhǎng)尾雞pmel基因上游序列與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果

圖2 壩上長(zhǎng)尾雞pmel基因從–1 200到+68bp序列中CpG島預(yù)測(cè)

2.3 壩上長(zhǎng)尾雞pmel啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建與活性分析

擴(kuò)增片段p1與pMD-19T載體連接體系：1 μL pMD-19T載體，1–4 μL PCR回收產(chǎn)物，5 μL SolutionⅠ，用ddH2O補(bǔ)足至10 μL，16 ℃連接，對(duì)重組T載體進(jìn)行雙酶切，將目的片段通過(guò)T4 DNA連接酶連接到表達(dá)載體pGL3-Basic，構(gòu)建表達(dá)載體P1，再以P1為模板依次構(gòu)建P2–P9，對(duì)表達(dá)載體(P1–P9及Basic) 進(jìn)行雙酶切(圖3)、測(cè)序鑒定，提取無(wú)內(nèi)毒質(zhì)粒并檢測(cè)其濃度和純度。

以不同的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)，圖4可知表達(dá)載體P1–P9的 活性與Basic有顯著差異(<0.05)，報(bào)告基因 P2 (?840–+68)轉(zhuǎn)染活性值最高，該活性值是對(duì)照組的40倍，表明?840–+68 bp區(qū)域?yàn)殡u基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域，?840–?590 bp和?525–?266 bp區(qū)域是重要的正調(diào)控區(qū)，?590–?525 bp區(qū)域是重要的負(fù)調(diào)控區(qū)。

2.4 壩上長(zhǎng)尾雞pmel啟動(dòng)子區(qū)基因型檢測(cè)

壩上長(zhǎng)尾雞啟動(dòng)子?840–?185 bp區(qū)域檢測(cè)到12個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中?732、?654、?410、?326、?185位點(diǎn)在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中未公布(表2)，啟動(dòng)子活性降低最為顯著的兩個(gè)區(qū)域是?840–?793 bp和?403–?266 bp，且?525–?266 bp區(qū)域是重要的正調(diào)控區(qū)，?840–?793 bp區(qū)域未檢測(cè)到多態(tài)，?525–?266 bp區(qū)域檢測(cè)到7個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。

圖3 表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物凝膠電泳

圖4 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞的相對(duì)熒光活性值

2.5 壩上長(zhǎng)尾雞pmel核心啟動(dòng)子區(qū)突變載體的構(gòu)建與活性分析

選擇核心啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)?525–?266 bp區(qū)域7個(gè)多態(tài)位點(diǎn)為雜合或與P2這7個(gè)位點(diǎn)堿基不同，其他多態(tài)位點(diǎn)為純合的序列，按照以上載體構(gòu)建的方法，構(gòu)建核心啟動(dòng)子區(qū)突變載體(mut-1) (圖5)，轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，對(duì)報(bào)告基因進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)，mut-1顯著高于P2的活性值(<0.05) (圖6)，由此推測(cè)，?456、?435、?410、?374、?341位點(diǎn)多態(tài)的發(fā)生對(duì)啟動(dòng)子活性有影響。

表2 壩上長(zhǎng)尾雞多態(tài)位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率

圖5 P2和mut-1多態(tài)位點(diǎn)所在區(qū)域測(cè)序結(jié)果(箭頭提示多態(tài)位點(diǎn))

圖6 核心啟動(dòng)子區(qū)的活性分析

3 討論

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)過(guò)程中重要的一步，轉(zhuǎn)錄起始是眾多順式作用元件和反式作用因子之間相互作用的結(jié)果。基因是影響羽色形成的重要基因，通過(guò)和其他基因互作對(duì)皮膚毛色形成以及其他組織色素形成均有作用，本研究構(gòu)建了9個(gè)含有不同長(zhǎng)度雞基因啟動(dòng)子片段的表達(dá)載體(P1–P9) 及1個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)突變載體(mut-1)，確定了雞基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域?yàn)?840–+68 bp，?840–?590 bp和?525–?266 bp區(qū)域?yàn)檎{(diào)控區(qū)，存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Sp1、AP-2、GATA-1、NF-κB、YY1、USF、SRF、Oct-1和C/EBP) 結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)啟動(dòng)子起正調(diào)控作用。

啟動(dòng)子從–840 bp截短至–793 bp、–403 bp截短至–266 bp啟動(dòng)子活性降低最為明顯，啟動(dòng)子相對(duì)活性值P2是P3的3.44倍，P8是P9的8.4倍，該區(qū)域也是Sp1分布最為集中的區(qū)域，從–793 bp截短至–590 bp啟動(dòng)子活性降低較為顯著，啟動(dòng)子相對(duì)活性P3是P5的2.12倍，Sp1分布較為集中。Sp1的DNA結(jié)合區(qū)域特異性地識(shí)別GC盒(GGGGCGGGG) 與GT盒(GGTGTGGG)[14]，GC/GT常以多拷貝形式分布于基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子中[15]，Sp1也可直接與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的TFIID復(fù)合物相互作用。在低氧狀態(tài)下人內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) 啟動(dòng)子GC富集區(qū)插入Sp1結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，可減輕部分心血管疾病中存在的微循環(huán)障礙[16]。此外Sp1也可與多種轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控基因表達(dá)，例如，Sp1和AP-2的表達(dá)上調(diào)或下降共同調(diào)控不同靶基因的表達(dá)[17]。轉(zhuǎn)錄因子YY1在多種組織中廣泛表達(dá)，YY1能作為啟動(dòng)元件結(jié)合蛋白啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，通過(guò)與其他蛋白的相互作用發(fā)揮間接激活或抑制，YY1與Sp1共同作用于HAS2基因的表達(dá)[18-19]。USF可與啟動(dòng)子上E-box順式調(diào)控序列結(jié)合[20-21]，低氧條件下，過(guò)表達(dá)Sp1和USF激活A(yù)DAMTS1啟動(dòng)子活性，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，Sp1和USF異常表達(dá)會(huì)降低ADAMTS1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá) 量[22]。SRF可與SMYD1啟動(dòng)子上CArG位點(diǎn)結(jié)合上調(diào)SMYD1在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)[23]。GATA-1是轉(zhuǎn)錄因子GATA蛋白家族成員之一，可以通過(guò)(A/T) GATA (A/G) 與基因啟動(dòng)子結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄[24]。Sp1協(xié)同Gata3、MafB、Gcm2轉(zhuǎn)錄因子激活甲狀旁腺素基因的表達(dá)[25-26]。NF-κB是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)因子，由P50和P65組成的二聚體，調(diào)節(jié)許多與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化相關(guān)的基因表達(dá)，馮怡的研究表明NF-κB上調(diào)SET基因的表達(dá)[27]。Toll樣受體9 () 在黑素原生成過(guò)程中具有重要作用，與色素增強(qiáng)或減退相關(guān)的疾病關(guān)系密切，在人黑素細(xì)胞系(PIG1) 黑素合成過(guò)程中NF-κB通過(guò)激活調(diào)控黑色素的合成，對(duì)人基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有增強(qiáng)作 用[28]。CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP) 家族是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個(gè)亞家族，其蛋白質(zhì)分子包括3個(gè)相似的結(jié)構(gòu)組分：C末端的亮氨酸拉鏈，N末端的轉(zhuǎn)錄激活域，中間的DNA 結(jié)合域，結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活特定基因DNA增強(qiáng)子5?-RTTGCGYAAY-3?(R＝A或G，Y＝C或T) 重復(fù)序列或其變異體，故可以對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行正、負(fù)調(diào)控[29-31]。已有研究表明，小鼠上過(guò)表達(dá)Oct-1后使黑素細(xì)胞中的表達(dá)降低，的表達(dá)增加，改變毛色[32]。

啟動(dòng)子?590–?403 bp區(qū)域Sp1分布最少，負(fù)調(diào)控區(qū)?590–?525還存在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控位點(diǎn)CREB、RAP1。已有研究表明，SKOV3細(xì)胞增殖受基因下調(diào)的影響，卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達(dá)較高，其會(huì)對(duì)漿液性癌細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制[33]。CREB是真核生物細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控因子，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性形成以及疾病發(fā)生等復(fù)雜的生理病理過(guò)程，可以刺激基因轉(zhuǎn)錄，通過(guò)自身的磷酸化實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的功能，故又稱為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子[34]。而郭姍姍的研究表明CREB對(duì)的表達(dá)有下調(diào)作用[35]。本實(shí)驗(yàn)中P6沒(méi)有CREB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，活性顯著大于P5，進(jìn)一步截去Rap1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，P7啟動(dòng)子活性顯著增強(qiáng)，推測(cè)CREB、Rap1可能對(duì)啟動(dòng)子起負(fù)調(diào)控作用。有研究表明人無(wú)心肌細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)與內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)減少相關(guān)，會(huì)引起心室衰竭、血管收縮障礙[36]。本實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)子?840–?185 bp區(qū)域檢測(cè)到12個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中?525–?266 bp區(qū)域檢測(cè)到7個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。表達(dá)載體mut-1顯著高于P2的活性值(<0.05)，由此推測(cè)?456、?435、?410、?374、?341位點(diǎn)多態(tài)的發(fā)生對(duì)啟動(dòng)子活性有影響，可能是多態(tài)的出現(xiàn)改變了轉(zhuǎn)錄因子與序列的結(jié)合。由于基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是受到多種調(diào)控元件的協(xié)同作用，仍需通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀和電泳遷移變動(dòng)分析試驗(yàn)進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

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Identification of the core promoter of thegene of Bashang long-tail chickens

Xiaohui Liu1, Rongyan Zhou1, Yongdong Peng2, Chuansheng Zhang2, Lanhui Li1, and Xianglong Li1, 2

1 College of Animal Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei, China 2 College of Animal Science and Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao 066004, Hebei, China

To explore the activity of thecore promoter of Bashang long-tail chickens, we constructed dual-luciferase expression vectors and transiently transfected into DF1 cells with Lipofectamine 2000. We measured the luciferase activity with the dual-luciferase detection kit. The 1 268 bp fragment in 5￠-flanking region of thegene in Bashang long-tail chickens was cloned. The region from ?1 200 bp to +68 bp included 2 CpG islands and multiple transcription factor binding sites. We constructed 9 expression vectors with different promoter regions and a mutant vector of the core promoter region of thegene of Bashang long-tail chickens. The core promoter region from –840 bp to +68 bp was identified in thegene. The region from ?590 to ?525 bp negatively regulated thegene during the transcription process. The ?840–?590 bp and ?525–?266 bp regions were positive regulatory regions. The polymorphic sites (?456, ?435, ?410, ?374 and ?341) had a significant effect on the promoter activity of thegene.

Bashang long-tail chicken,gene, promoter, transcription factor

February 2, 2018;

May 30, 2018

The Earmarked Fund for Hebei Layer Innovation Team of Modern Agro-industry Technology Research System (No. HBCT2013090206), the Science and Technology Plan Projects of Hebei Province, China (No. 15226302D).

Xianglong Li. Tel: +86-335-8069521; E-mail: lixianglongcn@yahoo.com

10.13345/j.cjb.180050

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No. HBCT2013090206)，河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 15226302D) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)