UPLC/Q-TOF MS/MS技術(shù)評價(jià)防腐劑硼酸和疊氮化鈉對尿液代謝物的影響

肖 瑤，王美杰，侯紹英*

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081）

代謝組學(xué)是研究代謝產(chǎn)物變化規(guī)律的一門學(xué)科，自Nicholson等[1]于1999年提出“代謝組”一詞后，代謝組學(xué)在篩選疾病的生物標(biāo)志物[2-3]以 及療效評價(jià)[4]等多個(gè)方面展現(xiàn)出良好應(yīng)用前景。代謝組學(xué)分析流程包括樣品采集、樣品前處理、儀器檢測、數(shù)據(jù)分析等幾個(gè)環(huán)節(jié)，為了得到真實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各環(huán)節(jié)都需嚴(yán)格設(shè)計(jì)、精確執(zhí)行。其中，對樣品進(jìn)行適宜的前處理至關(guān)重要[5]。

尿液是代謝組學(xué)研究常用的生物樣本，它具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，尿液中含有豐富的代謝產(chǎn)物，并且大多數(shù)代謝產(chǎn)物能反映機(jī)體的代謝變化信息[6-7]；其次，尿液是機(jī)體的排泄廢物，采集方便、快捷，對生命體本身無侵襲性，并且收集的體積幾乎不受限制。但尿液樣本在收集過程中，常常會受細(xì)菌微生物等因素的影響，從而使其中的代謝物發(fā)生變化[8]，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的分析結(jié)果。為解決這一問題，很多學(xué)者在尿液樣品中添加防腐劑，以抑制細(xì)菌生長繁殖[9]，但其前提是這些防腐劑不影響尿液中的代謝物。此前曾有學(xué)者采用光學(xué)技術(shù)以及基于核磁共振波譜技術(shù)(nuclear magnetic resonance，NMR)的代謝組學(xué)技術(shù)探討了常用防腐劑作用效果以及對代謝物的影響。但由于NMR技術(shù)的靈敏度低于超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography tandem quadrupole time of flight mass spectrometry，UPLC/QTOF MS/MS)，而后者在代謝組學(xué)研究中應(yīng)用越來越廣泛，所以基于該技術(shù)平臺闡明防腐劑對尿液代謝物的影響就顯得很重要。因此，我們在尿液中添加兩種常用防腐劑硼酸和疊氮化鈉，在基于UPLC/Q-TOF MS/MS技術(shù)的代謝組學(xué)研究中觀察其對尿液代謝物的影響，篩選適宜的防腐劑及其適宜的濃度范圍，以便為后續(xù)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

采用Waters超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行樣品檢測。HSS T3色譜柱(1.8 μm，2.1×100 mm)購于Waters公司，色譜級乙腈和甲醇購于Dikma公司，色譜級甲酸購于Fisher公司，亮氨酸腦啡肽購于Sigma公司。采用Millipore公司的Milli-Q超純水系統(tǒng)制備超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與尿液處理 采用進(jìn)口離心管收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)6名健康志愿者的晨尿(男女各3名)，各取40 mL等量混勻并分裝。按處理方式不同分為3個(gè)組，即對照組、疊氮化鈉組(NaN3)和硼酸組(boric acid)，其中對照組不添加任何防腐劑，疊氮化鈉組中分別添加終濃度為0.1、1和10 mmol/L的疊氮化鈉；硼酸組則在尿液中分別添加終濃度為2、20和200 mmol/L的硼酸。

每個(gè)處理均設(shè)置4個(gè)平行樣。尿樣在4 ℃下以3 000 g離心5 min，吸取上清100 μL，加入1 100 μL超純水，渦旋混勻后，再次于4 ℃以12 000 g離心10 min。輕吸上清液1 000 μL置于進(jìn)樣瓶中。檢測時(shí)為避免誤差，將各組樣品隨機(jī)進(jìn)樣。

等量吸取所有樣品并混勻，制成質(zhì)控樣品(quality control，QC)。每隔15個(gè)樣品各采集一次QC和純乙腈(空白樣品)，以便進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.2 UPLC/Q-TOF MS/MS條件 采用Waters UPLC HSS T3色譜柱進(jìn)行樣品的分離。柱溫設(shè)置為35 ℃，自動進(jìn)樣室溫度設(shè)置為4 ℃。流動相A液為0.1%甲酸水溶液，B液為100%乙腈。流速為0.45 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。洗脫方法如表1所示。

表1 UPLC梯度洗脫程序

質(zhì)譜分析器由四級桿質(zhì)譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜儀串聯(lián)而成，采用電噴霧離子源(electrospray ion source，ESI)分別采集正、負(fù)兩個(gè)離子模式下質(zhì)荷比50~1 200范圍的離子。質(zhì)譜掃描采用MSE連續(xù)模式，采集時(shí)間為0~16 min。質(zhì)譜分析參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓為0.5 kV，錐孔電壓為60 V，離子源溫度為110 ℃，脫溶劑氣溫度為450 ℃，錐孔氣流為50 L/h，脫溶劑氣流為900 L/h。在整個(gè)檢測過程中，使用200 pg/μL的亮氨酸腦啡肽作為質(zhì)譜校正離子([M+H]+=556.277 1，[M+H]-=554.261 5)進(jìn)行儀器的實(shí)時(shí)校正，掃描時(shí)間為0.2 s，間隔時(shí)間為15 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將檢測得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI軟件(Waters)進(jìn)行峰識別、峰提取和歸一化后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP 13.0軟件(Umetrics)，采用主成分分析(principal components analysis，PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal projection to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行分析。根據(jù)變量權(quán)重的重要性排序值(variable importance in projection，VIP)進(jìn)一步篩選具有差異的變量，選擇其中差異倍數(shù)大于2且P<0.05者為差異代謝物。

2 結(jié) 果

2.1 儀器的穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)的可靠性

分別采用空白樣品和QC樣品，對實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行質(zhì)量控制。對4個(gè)空白樣品的色譜圖重疊處理后(圖1A)發(fā)現(xiàn)它們的色譜圖重疊在一起，沒有額外的色譜峰出現(xiàn)，說明整個(gè)分析過程中色譜柱中沒有物質(zhì)殘留，不存在交叉污染問題。

對各處理組樣品和QC進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)在PCA得分圖中(圖1B)，QC樣品聚集并位于所有樣品的中間，說明了系統(tǒng)的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的可靠性。

2.2 防腐劑種類和濃度對尿液代謝物的影響

我們分別在正負(fù)兩個(gè)離子模式下進(jìn)行了數(shù)據(jù)采集。正離子模式下，對所有防腐劑組和對照組進(jìn)行分析，觀察各組數(shù)據(jù)的聚類情況，結(jié)果如PCA得分圖(圖2A，R2X=0.913，Q2=0.882)，說明模型的擬合度和預(yù)測性良好。在PLS-DA得分圖(圖2B，R2Y=0.243，Q2=0.050)中可以看出，終濃度為2、20 mmol/L的硼酸處理組，以及0.1、1和10 mmol/L NaN3處理組，均與對照組樣品聚集在一起，沒有明顯的分離趨勢；而終濃度為200 mmol/L硼酸處理組與對照及其他樣品組顯著分離，提示加入硼酸的終濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)對尿液的代謝物有影響。

圖1 儀器的穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)可靠性評估圖

為了更好觀察對照組與2、20 mmol/L硼酸處理組以及NaN3處理組之間的差異，我們暫時(shí)將200 m mol/L硼酸組移除，再次進(jìn)行PLS-DA分析(圖2C，R2Y= 0.140，Q2=0.035)，發(fā)現(xiàn)對照組樣品與這些處理組的尿樣之間沒有分離趨勢，說明加入終濃度為2~20 mmol/L 硼酸和0.1~10 mmol/L NaN3不會對尿液代謝產(chǎn)物產(chǎn)影響。

圖2 不同防腐劑處理組與對照組比較的分析圖

對負(fù)離子模式下的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，我們發(fā)現(xiàn)終濃度為20和200 mmol/L硼酸處理組樣品與對照及其他組樣品有明顯的分離趨勢。

2.3 200 mmol/L硼酸處理對尿液代謝物的影響

對200 mmol/L硼酸組和對照組作PCA和PLS-DA分析(圖3A，R2X=0.963，Q2=0.921；圖3B，R2Y=0.976，Q2=0.949)，發(fā)現(xiàn)兩組樣品得到很好的區(qū)分，說明模型穩(wěn)定且有較高的預(yù)測性。為了防止過度擬合，進(jìn)一步對該P(yáng)LS-DA模型做了置換檢驗(yàn)(圖3C)，圖中左側(cè)隨機(jī)實(shí)驗(yàn)數(shù)值均低于右側(cè)原始值，說明模型的有效性。

進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA分析(圖3D)，可看到200 mmol/L硼酸組和對照組顯著分離，該模型的R2=0.976，Q2=0.955。為了觀察在兩組有顯著差異的代謝物，我們篩選VIP>1、差異倍數(shù)大于2倍，且P<0.05的代謝物，最終得到235個(gè)差異代謝物，與對照組相比其中有147個(gè)的濃度升高，88個(gè)濃度降低。在負(fù)離子模式下，我們得到更多的差異代謝物，其中VIP>2的差異代謝物有92個(gè)。以上結(jié)果說明經(jīng)200 mmol/L硼酸處理后，尿液代謝物有明顯改變，所以不宜應(yīng)用于基于UPLC/Q-TOF MS/MS技術(shù)的尿液代謝組學(xué)研究。

圖3 濃度為200 mmol/L的硼酸處理對尿液代謝物影響分析圖

3 討 論

在代謝組學(xué)研究中，采用適宜的樣品前處理方法以保證樣品真實(shí)反映機(jī)體生理病理狀態(tài)，這一點(diǎn)至關(guān)重要[5，10]。尿液是代謝組學(xué)研究中常用的樣品，在收集過程易受到微生物的污染。在室溫下，尿液中細(xì)菌菌落數(shù)變化顯著，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的臨床診斷[9]。而細(xì)菌繁殖可消耗葡萄糖、還原硝酸鹽或者分解尿素使pH升高，使尿液成分發(fā)生改變，最終結(jié)果可能無法真實(shí)反映機(jī)體的病理生理狀態(tài)。Rotter等[8]通過流動注射電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜靶標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)人類尿液在室溫(20℃)存放24 h后，精氨酸、色氨酸和己糖等6種代謝物明顯下降。由此可見，控制微生物污染對樣品成分的影響至關(guān)重要，NaN3和硼酸等防腐劑能有效抑制微生物繁殖，但目前的證據(jù)大多是基于NMR技術(shù)的，考慮到UPLC/Q-TOF MS/MS技術(shù)的靈敏度更高，且應(yīng)用越來越廣泛，因此本文采用UPLC/Q-TOF MS/MS技術(shù)探討NaN3和硼酸這兩種防腐劑對尿液代謝物的影響，最終發(fā)現(xiàn)0.1~10 mmol/L的NaN3和2 mmol/L的硼酸適于基于UPLC/Q-TOF M S/MS技術(shù)的尿液代謝組學(xué)研究。

研究中人們常采用多種防腐劑進(jìn)行樣品處理以消除微生物繁殖引起的代謝物改變，有學(xué)者研究了多種防腐劑的抑菌效果。Thongboonkerd等[11]研究了2~200 mmol/L硼酸和0.1~10 mmol/L NaN3的防腐效果。他們分別采用紫外可見分光光度法和革蘭氏染色對細(xì)菌的繁殖進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)以上濃度的兩種防腐劑可以有效抑制細(xì)菌生長，而且10 mmol/L NaN3和200 mmol/L硼酸組中的防腐作用能至少持續(xù)48 h，因此認(rèn)為200 mmol/L硼酸和10 mmol/L NaN3的抑菌效果更好。Eisinger等[9]采用尿液防腐管(BD Vacutainer Plus Urine C&S reservative Tubes，主要成分是硼酸和甲酸鈉等)發(fā)現(xiàn)其可以有效抑制細(xì)菌生長長達(dá)48 h，但他們沒有進(jìn)行其他方面的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。而Eksioglu等[12]則采用另一種尿液防腐管(BD Vacutainer?Plus Urinalysis Preservative Tubes，主要成分是丙酸鈉)，在不同時(shí)間點(diǎn)對防腐管中尿液進(jìn)行生化指標(biāo)的分析，發(fā)現(xiàn)4 h后樣品中蛋白質(zhì)減少了20%；48 h后血紅蛋白減少了36%，白細(xì)胞酶減少了23%，該結(jié)果提示尿液中的代謝物發(fā)生了改變。以上研究均說明，在基于光學(xué)技術(shù)或者一般生化檢測技術(shù)的研究中，NaN3和硼酸能有效抑制尿液樣品中微生物的繁殖。但由于代謝組學(xué)中常用的液質(zhì)聯(lián)用和NMR等技術(shù)的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這些傳統(tǒng)的技術(shù)，所以這些防腐劑是否仍適用于代謝組學(xué)中尿液樣品的處理，仍值得進(jìn)一步探討。

Smith等[13]采 用基于1H NMR技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，0~30 mmol/L的硼酸鹽與甘露醇、檸檬酸等化學(xué)物之間相互作用，但與個(gè)體差異相比，該變化非常微弱，因此認(rèn)為0~30 mmol/L的硼酸可應(yīng)用于基于NMR技術(shù)的尿液代謝組學(xué)研究。但由于NMR相對靈敏度低、動態(tài)范圍有限[14]，而UPLC/Q-TOF MS/MS的靈敏度和分辨率顯著高于NMR[15]， 所以Smith等[13]的結(jié)果并不能直接應(yīng)用于基于UPLC/Q-TOF MS/MS的代謝組學(xué)研究。Roux等[16]在尿液中添加200 mmol/L硼酸，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)，加入200 mmol/L硼酸的尿樣與未加入者有一定分離趨勢，因此認(rèn)為200 mmol/L硼酸雖能抑制細(xì)菌生長，但對尿液中的代謝物有一定影響，該結(jié)果與本文一致。本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)雖然在正離子模式下20 mmol/L硼酸未對尿液代謝圖譜產(chǎn)生明顯影響，但在負(fù)離子模式下20 mmol/L硼酸處理后的尿液樣品與對照組有明顯分離趨勢，因此我們認(rèn)為將硼酸作為防腐劑應(yīng)用于尿液代謝組學(xué)研究時(shí)，濃度應(yīng)低于20 mmol/L。

Lauridsen等[17]使用NaN3作為防腐劑處理尿液樣品，采用NMR技術(shù)對樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)0.1% NaN3(相當(dāng)于15.38 mmol/L)處理的樣品與對照組沒有分離趨勢，說明0.1% NaN3適于基于NMR技術(shù)的尿液代謝組學(xué)研究。本研究發(fā)現(xiàn)10 mmol/L NaN3處理對尿液代謝圖譜無明顯影響，該濃度比Lauridsen等[17]所用的NaN3濃度要低，但考慮UPLC/Q-TOF MS/MS檢測技術(shù)的靈敏度，同樣可以認(rèn)為添加NaN3對尿液代謝物影響較小。

綜上所述，在基于UPLC/Q-TOF MS/MS技術(shù)的尿液代謝組學(xué)研究中，我們發(fā)現(xiàn)0.1~10 mmol/L NaN3和2 mmol/L硼酸可有效抑制微生物的繁殖，同時(shí)對尿液中的代謝物影響較小，是比較適宜的尿液樣品的處理方法。但高濃度的硼酸到底影響了哪些代謝產(chǎn)物，尚需進(jìn)一步確認(rèn)。