一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信號(hào)的影響

王林佳，張 纓

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一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信號(hào)的影響

王林佳，張 纓

北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)教研室 北京 100084

目的：探討一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信號(hào)的影響。方法：HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只。隨機(jī)分為野生安靜組（WC組）、野生運(yùn)動(dòng)組（WE組）、轉(zhuǎn)基因安靜組（HC組）和轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組（HE組）。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)運(yùn)動(dòng)組小鼠做遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)直至力竭，運(yùn)動(dòng)后即刻取材，脫頸處死后取兩側(cè)小腿骨骼肌。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定骨骼肌Nrf2下游抗氧化基因表達(dá)，Western Blot法測(cè)定骨骼肌中蛋白表達(dá)，高質(zhì)熒光測(cè)定法測(cè)定小鼠骨骼肌ROS。結(jié)果：1）與WC組相比，HC組小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，Nrf2-ARE結(jié)合活性顯著增加，靶基因SOD1、SOD2、NQO-1 mRNA表達(dá)顯著增加，NQO-1蛋白表達(dá)顯著增加，骨骼肌ROS水平極顯著下降；2）與HC組相比，HE組小鼠骨骼肌核蛋白Nrf2含量顯著性增加，SOD2和NQO-1 mRNA表達(dá)量顯著增加，且NQO-1蛋白表達(dá)顯著增加，ROS無(wú)明顯變化；3）與WE組相比，HE組小鼠Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，Nrf2核蛋白及P-Nrf2表達(dá)增加。骨骼肌SOD2和NQO-1mRNA表達(dá)增加，NQO-1蛋白表達(dá)顯著增加，骨骼肌ROS含量極顯著下降。結(jié)論：適當(dāng)?shù)腍IF-1α高表達(dá)可提高安靜狀態(tài)下小鼠骨骼肌Nrf2-ARE通路的激活，且對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌ROS的消除也有積極的調(diào)節(jié)作用。

運(yùn)動(dòng)；氧化應(yīng)激；核因子E2相關(guān)因子2；低氧誘導(dǎo)因子1-α亞基

低氧訓(xùn)練作為提高運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力的輔助措施，是運(yùn)動(dòng)員經(jīng)常采用的訓(xùn)練方法之一[21]。運(yùn)動(dòng)和環(huán)境低氧可刺激機(jī)體使之產(chǎn)生適應(yīng)[6,8]。低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是調(diào)節(jié)機(jī)體缺氧適應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子。其功能性亞基HIF-1α發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用，低氧和運(yùn)動(dòng)均可促進(jìn)其表達(dá)[4,12]。

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2，Nrf2）是機(jī)體氧化應(yīng)激中起著中樞調(diào)節(jié)作用的一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子[16]。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2與胞漿中的keap1蛋白結(jié)合并被固定在胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2與keap1蛋白解離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與核內(nèi)Maf蛋白二聚化后可識(shí)別并結(jié)合靶基因DNA啟動(dòng)子序列——抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE），促進(jìn)下游靶基因抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，如超氧化物歧化酶（SOD）、醌氧化還原酶（NQO-1）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等一系列抗氧化和Ⅱ相解毒酶。提高機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力[9,15]。綜上所述，Nrf2-ARE系統(tǒng)在機(jī)體抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮著非常重要作用[9]。

運(yùn)動(dòng)、低氧可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡破壞[4,15]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的高表達(dá)可能在機(jī)體對(duì)低氧適應(yīng)中起到保護(hù)作用，但HIF-1α高表達(dá)對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠骨骼肌Nrf2-ARE通路的影響目前并不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用野生鼠與HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠，探討安靜狀態(tài)和一次性力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠骨骼肌Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)的變化，進(jìn)一步揭示HIF-1α和骨骼肌Nrf2抗氧化信號(hào)的關(guān)系。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

健康8周齡C57BL/6J小鼠20只（W），誘導(dǎo)型HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠20只（H），HIF-1α采用C57BL/6J小鼠制做HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠[22]。所有小鼠均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，體重為18±2 g。兩種小鼠骨骼肌內(nèi)HIF-1α蛋白檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

圖1 小鼠骨骼肌HIF-1α蛋白表達(dá)

Figure 1. Expression of HIF-1α Protein in Mice

注：@表示與野生鼠比較＜0.05，下同。

1.2 研究對(duì)象分組

HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只。隨機(jī)分為野生安靜組（WC組）、野生運(yùn)動(dòng)組（WE組）、轉(zhuǎn)基因安靜組（HC組）和轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組（HE組）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動(dòng)物房，分籠飼養(yǎng)，每籠3~4只，溫度保持在20~25℃，相對(duì)濕度保持在50%~70%，每天進(jìn)行12 h模擬自然光照射。動(dòng)物飼養(yǎng)采用國(guó)家嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料，整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程中動(dòng)物能夠自由進(jìn)食和飲水。

1.3 運(yùn)動(dòng)方式

HC組、HE組小鼠均進(jìn)行一次性遞增負(fù)荷至力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度為5%，起始速度為10 m/min，每3 min增加1級(jí)，直至力竭（表1）。

表1 本研究小鼠遞增負(fù)荷至力竭的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案

Table 1 Exhaustion Exercise Running Scheme of Mice

適應(yīng)性訓(xùn)練在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩天進(jìn)行，共進(jìn)行2天，時(shí)間為10 min/天。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為電擊10 s仍不運(yùn)動(dòng)即視為已達(dá)到力竭。

1.4 取材

所有小鼠均采用脫頸處死，運(yùn)動(dòng)組小鼠運(yùn)動(dòng)后即刻取材，取小腿腓腸肌，用錫紙包裹，標(biāo)記，投入液氮中。而后，將所有取好的組織存入-80℃冰箱，保存待用。

1.5 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器及方法

1.5.1 酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定骨骼肌總蛋白Nrf2-ARE結(jié)合活性

采用美國(guó)Pierce公司生產(chǎn)的蛋白濃度試劑盒，通過(guò)BCA方法，測(cè)定蛋白勻漿液蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，計(jì)算各樣品蛋白含量，調(diào)整為10 μg所需稀釋比例。采用美國(guó)Active Motif公司生產(chǎn)的Trans AM Nrf2試劑盒測(cè)定Nrf2-ARE結(jié)合活性，操作完全按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果以（測(cè)定孔OD值－空白孔OD值）/[對(duì)照組（測(cè)定孔OD－空白孔OD值）平均值]表示。

1.5.2 骨骼肌蛋白提取

將100 mg骨骼肌加入800 μl裂解液A（已加入EDTA）中，勻漿機(jī)高速充分勻漿；于冰上靜置10 min，渦旋振蕩 5 s，再于冰上靜置10 min，渦旋振蕩5 s，15 000 rpm，4℃離心10 min；取上清即為胞漿蛋白，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 Western Blot測(cè)定骨骼肌蛋白表達(dá)

采用美國(guó)Pierce公司生產(chǎn)的蛋白濃度試劑盒，BCA法測(cè)定骨骼肌的胞漿蛋白及核蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的核蛋白濃度以及上樣蛋白量20 μg計(jì)算上樣的體積。采用美國(guó)life technologies 公司生產(chǎn)的Bolt 4%~12% Bis-Tris Plus凝膠，電泳分離目的蛋白及內(nèi)參，而后采用美國(guó)Invitrogen公司的iBlot2進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂牛奶封閉1 h，加一抗于4℃孵育過(guò)夜。一抗稀釋比例為：Nrf2（SC-722，1:200），p-Nrf2（Ser40）（BS-2013R 1:1 000），NQO-1（SC-16464，1:500），SOD1（SC-11407，1:500），SOD2（SC-30080， 1:3 000），CAT（SC-50508，1:500），內(nèi)參蛋白β-actin（SC-47778，1:1 000），H1（SC-10806，1：1 500）。次日以1×TBST洗3次，每次10 min。加二抗室溫孵育1 h，然后1×TBST洗3次，每次10 min。洗膜后，加入發(fā)光液（Thermo 34095），曝光結(jié)果采用Image Lab軟件讀取條帶積分灰度值，結(jié)果用以下公式計(jì)算的比值表示。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定骨骼肌抗氧化基因mRNA表達(dá)量

取小鼠骨骼肌50 mg，瀝干，加入0.8 ml Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），組織研磨、分相、分離、洗滌和提純總RNA。采用日本Toyobo公司生產(chǎn)的熒光染料反應(yīng)體系（SYBR Green Realtime PCR Master Mix）及引物Nrf2（QT00095270），SOD1（QT00165039），SOD2（QT00161707），CAT（QT01058106），NQO-1（QT00094357）。采用美國(guó)ABI7500熒光定量PCR儀測(cè)定SOD1等基因mRNA水平，用該儀器自帶軟件讀取熒光定量CT值。目的基因結(jié)果以比較CT法相對(duì)定量表示。計(jì)算公式為：目的基因=2-△△CT。

1.5.5 熒光比色法測(cè)定小鼠骨骼肌ROS含量

采用GENMED高質(zhì)熒光測(cè)定試劑盒測(cè)定小鼠骨骼肌ROS含量：取小鼠100 mg的腿部腓腸肌，勻漿，離心后測(cè)定蛋白濃度?，F(xiàn)配染色液工作液2 000 μl：10 μl染色液+ 190 μl預(yù)熱的稀釋液C，加入190 μl的染色液，37℃水槽孵育20 min，避免光照。熒光分光光度計(jì)：激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，散發(fā)波長(zhǎng)520 nm。

1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用雙因素方差分析處理數(shù)據(jù)。若有交互作用則采用簡(jiǎn)單效應(yīng)檢驗(yàn)，若無(wú)交互作用則采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果用M±SE表示。＜0.05和＜0.01表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義，其中，＜0.05表示有顯著性差異，＜0.01表示有非常顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 HIF-1α對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和Nrf2、p-Nrf2、核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，HC組與WC組相比，小鼠Nrf 2mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加（＜0.05）。pNrf2和核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。WE組與WC組相比，小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA顯著增加，Nrf2蛋白表達(dá)有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著性，小鼠骨骼肌pNrf2和核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。HE組與HC組相比，小鼠Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性。HE組與WE組相比，小鼠Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加（＜0.05），P-Nrf2和核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加（＜0.05）。

圖2 小鼠骨骼肌Nrf2mRNA表達(dá)、Nrf2、p-Nrf2、核蛋白Nrf2蛋白表達(dá)

Figure 2. Expression of Nrf2 mRNA and Nrf2/p-Nrf2/ Nuclear Nrf2 Protein in Mice

注：*表示與WC組相比＜0.05，#表示與WE組相比＜0.05，&表示與HC組相比＜0.05，下同。

2.2 HIF-1α對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性和Nrf2靶基因mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，HC組與WC相比，小鼠Nrf2-ARE結(jié)合活性顯著增加，Nrf2下游靶基因SOD1、SOD2及NQO-1 mRNA表達(dá)顯著增加。WE組與WC組相比，小鼠骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性顯著增加，小鼠骨骼肌SOD1、SOD2 mRNA表達(dá)顯著增加，CAT和NQO-1 mRNA表達(dá)量雖有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著性。HE組與HC組相比，小鼠骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性無(wú)明顯變化。HE組與WE組相比，小鼠Nrf2-ARE結(jié)合活性無(wú)明顯變化，小鼠骨骼肌SOD2和NQO-1 mRNA表達(dá)顯著增加，SOD1、CAT mRNA表達(dá)雖有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著性。HE組與WE組相比，小鼠SOD1和CAT mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，SOD 2mRNA表達(dá)量顯著增加，NQO-1 mRNA表達(dá)極顯著增加。

圖3 小鼠骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性和Nrf2靶基因表達(dá)

Figure 3. Nrf2-ARE Binding Activity and Expression of Nrf2 Target Genes in Mice

2.3 HIF-1α對(duì)小鼠骨骼肌抗氧化酶表達(dá)的影響

如圖4所示，HC組與WC相比，小鼠Nrf2下游靶基因SOD1、SOD2、CAT、NQO-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。WE與WC相比，小鼠骨骼肌SOD1、SOD2、CAT、NQO-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。HE組HC組相比，小鼠骨骼肌SOD1、SOD2、CAT、NQO-1均增加，但僅有NQO-1蛋白表達(dá)具有顯著性增加。HE組與WE組相比，小鼠Nrf2下游靶基因SOD1、SOD2、CAT、NQO-1均出現(xiàn)增加，但僅有NQO-1蛋白表達(dá)具有顯著性增加。

圖4 小鼠骨骼肌抗氧化蛋白表達(dá)

Figure 4. Expression of Peroxiredoxins in Mice

2.4 HIF-1α對(duì)小鼠骨骼肌ROS水平的影響

由圖5可知，HC組小鼠骨骼肌ROS水平極顯著低于WC組。WE組與WC組相比，小鼠骨骼肌ROS出現(xiàn)增加趨勢(shì)但無(wú)顯著差異。HE組與HC組相比，小鼠骨骼肌ROS無(wú)明顯變化。HE組小鼠骨骼肌ROS極顯著低于WE組。

圖5 小鼠骨骼肌ROS水平

Figure 5. The ROS Level in Skeletal of Mice

注：**表示與WC組相比＜0.01，##表示與WE組相比＜0.01。

3 分析討論

3.1 安靜狀態(tài)HIF-1α高表達(dá)對(duì)小鼠骨骼肌抗氧化信號(hào)影響

目前研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α高表達(dá)對(duì)機(jī)體的多個(gè)方面都具有調(diào)節(jié)作用。通過(guò)轉(zhuǎn)染使GRC-1細(xì)胞HIF-1α高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平會(huì)受到HIF-1α的影響。HIF-1α可作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，從而避免鈣超載[3]。Lunde等[13]對(duì)成年大鼠誘導(dǎo)14天使HIF-1α高表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，肌纖維橫截面面積增加，氧化酶活性增強(qiáng)和肌凝蛋白增加。然而，HIF-1α高表達(dá)對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響，目前缺乏文獻(xiàn)報(bào)道，因此，本研究試圖通過(guò)對(duì)野生鼠和HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌內(nèi)Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)通路各指標(biāo)的對(duì)比，探究HIF-1α高表達(dá)對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響。

在本實(shí)驗(yàn)中，安靜狀態(tài)下，HIF-1α高表達(dá)小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯高于野生鼠。這可能是通過(guò)HIF-1α對(duì)其下游靶基因的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)。促紅細(xì)胞生成素（EPO）是位于HIF-1α下游的一種細(xì)胞因子，它可以刺激骨髓造血功能，促進(jìn)紅細(xì)胞生成。同時(shí)，它也被認(rèn)為是一種具有抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用的抗氧化劑，可以調(diào)控Nrf2的激活[5,11,12,17,24]。Genc等[7]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)人體SH-SY5Y細(xì)胞加入EPO孵育24 h后，Nrf2胞漿蛋白和核蛋白表達(dá)均升高。這提示，HIF-1α可能可以通過(guò)其下游的EPO促使Nrf2表達(dá)增加。此外，HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌內(nèi)Nrf2-ARE結(jié)合活性顯著高于野生鼠，這可能如文獻(xiàn)所述，Nrf2的活化與NF-κB這一炎性轉(zhuǎn)錄因子的活化存在著競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[23]，HO-1不僅是Nrf2的靶基因也是HIF-1α的靶基因。HIF-1α可上調(diào)血紅素加氧酶（HO-1）表達(dá)。而較多的HO-1可抑制NF-κB活化從而促進(jìn)上游蛋白Nrf2的解離及入核[2]。這也提示，HIF-1α對(duì)Nrf2-ARE結(jié)合活性的調(diào)控可以通過(guò)二者共同的靶基因HO-1來(lái)實(shí)現(xiàn)。

ROS是反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度的指標(biāo)，Nrf2可通過(guò)激活其下游抗氧化蛋白的表達(dá)來(lái)清除機(jī)體內(nèi)過(guò)多的ROS。李鐵瑛[1]的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌抗氧化蛋白SOD2顯著增加，反映氧化應(yīng)激程度的脂質(zhì)過(guò)氧化物4-HNE蛋白表達(dá)量低于野生鼠。本研究中，HIF-1α轉(zhuǎn)基因小鼠Nrf2靶基因mRNA（SOD1、SOD2、NQO-1）及抗氧化蛋白（SOD2、NQO-1）表達(dá)量顯著升高。與WC組小鼠相比，HIF-1α轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌ROS水平極顯著降低，與上述文獻(xiàn)所述結(jié)果一致。這表明，HIF-1α的高表達(dá)可以使小鼠骨骼肌Nrf2-ARE轉(zhuǎn)錄活性提高，抗氧化蛋白表達(dá)增多，以及抗氧化能力提高。

3.2 一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌抗氧化信號(hào)的影響

HIF-1α是介導(dǎo)機(jī)體對(duì)低氧適應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。低氧可刺激HIF-1α的表達(dá)[18]。而劇烈運(yùn)動(dòng)可使體內(nèi)自由基產(chǎn)生增多，過(guò)多的自由基會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激進(jìn)而造成組織損傷[5]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，在這種運(yùn)動(dòng)引起氧化應(yīng)激中，HIF-1α的高表達(dá)可能具有一定的保護(hù)作用[20]。適度低氧（10% O2）干預(yù)后，PC12細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)增多，細(xì)胞總抗氧化能力增強(qiáng)[25]。以上研究表明，HIF-1α的增加對(duì)于機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的調(diào)節(jié)具有積極作用，但它的增加是否通過(guò)Nrf2-ARE信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)并不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較野生鼠與HIF-1α轉(zhuǎn)基因鼠一次性力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌內(nèi)Nrf2 mRNA、蛋白表達(dá)、Nrf2-ARE結(jié)合活性及下游抗氧化靶基因及抗氧化蛋白表達(dá)的變化，來(lái)探討在一次性力竭運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激中，HIF-1α對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用及對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響。

在本研究中，HIF-1α轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)過(guò)一次性力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Nrf2核蛋白及p-Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加，而野生鼠在運(yùn)動(dòng)后并未出現(xiàn)變化。這可能是由于轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的HIF-1α高表達(dá)在安靜狀態(tài)時(shí)已經(jīng)造成了細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白有較多的累積，大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)造成的氧化應(yīng)激刺激促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌內(nèi)Nrf2的核易位及磷酸化。一次性遞增負(fù)荷至力竭運(yùn)動(dòng)后，本研究中，HE組小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于WE組，且下游靶基因SOD2及NQO-1 mRNA表達(dá)及NQO-1蛋白表達(dá)水平也顯著高于WE組。這提示，進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)，HIF-1α的高表達(dá)可以通過(guò)促進(jìn)小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)，使小鼠在高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)下依然可以保持較高的抗氧化能力，使機(jī)體免受氧化應(yīng)激所造成的損傷。

4 結(jié)論

適當(dāng)?shù)腍IF-1α高表達(dá)不但可提高安靜狀態(tài)下小鼠骨骼肌Nrf2-ARE通路的激活，而且對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌ROS的消除也有積極的調(diào)節(jié)作用。

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Effects of Acute Exhaustive Exercise on the Antioxidant Signal of Nrf2 in Skeletal Muscle of HIF-1α Transgenic Mice

WANG Lin-jia , ZHANG Ying

Beijing Sport University, Beijing 100084,China.

To examine the effect of HIF-1α on Nrf2-ARE antioxidant pathway in mice skeletal muscle after acute exhaustion exercise. Methods: HIF-1α high expression (H) and C57BL/6J mice (W) were used at 20 respectively and each kind of mice were randomly divided into two groups: control (C) and exercise (E). The treadmill exercise was preformed at the acute exhaustion exercise. On the day of acute exercise, mice allocated to perform treadmill running were subject to 5% incline and 5min at 10m/min, and then increased 3m/min every 3 minutes. Mice were sacrificed at the indicated time points following treadmill running.Nrf2, phosphor-Nrf2 (Ser40), nuclear Nrf2 protein were measured by Western Blot and Nrf2-ARE binding activity, the mRNA and proetin levels of Nrf2 target genes, key antioxidant enzymes (SOD1, SOD2, CAT, NQO-1) and ROS level, were also measured in skeletal muscles after the interventions. Results: 1) The results showed that compared with WC, RNA and protein expression level of Nrf2 were increased in HC skeletal muscles. Nrf2-ARE binding activity, Nrf2 target gene SOD1, SOD2, NQO-1 mRNA expression and NQO-1 protein expression were also increased in HC skeletal muscles. Meanwhile, ROS level in HC skeletal muscles decreased significantly. 2) After the acute exhaustion exercise, high HIF-1α expression mice (HE) had higher expression of p-Nrf2 (Ser 40) and nuclear Nrf2 protein than the wide type mice (WE). The mRNA expression of SOD1 and mRNA /protein of NQO-1 in HE increased as well. In contrast, ROS level decreased significantly in HE muscles. Conclusion: The result indicated that the proper high expression of HIF-1α could promote the antioxidant capacity of skeletal muscle in mice through Nrf2-ARE pathway.

G804.7

A

1000-677X(2018)11-0060-06

10.16469/j.css.201811006

2018-08-08；

2018-11-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471134)。

王林佳,女,在讀博士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生物化學(xué),E-mail:489499191@qq.com。

張纓,女,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與骨骼肌代謝, E-mail:zhyi9256@126.com。