超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉、代用茶和飲料食品中63種非法添加化合物

唐維英, 黃澤瑋, 錢廣生, 魏宇濤, 黃 瑛, 徐小平, 余曉琴*

(1. 四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院, 四川 成都 610097; 2. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院, 四川 成都 610041)

非法添加是指使用食品添加劑以外的任何化學(xué)物質(zhì)和可能危害人體健康的物質(zhì)[1],其中非法添加的具有解熱鎮(zhèn)痛效果的化合物主要有糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥、抗組胺藥和抗生素[2]等化合物,這些藥物通過(guò)各種途徑產(chǎn)生解熱鎮(zhèn)痛的效果[3]。近年來(lái),隨著國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)加大力度對(duì)保健品的監(jiān)督檢查,不法商家開始將非法添加轉(zhuǎn)至普通食品中,其形式多樣、檢測(cè)分析難度大,如近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的配制酒中添加壯陽(yáng)類化合物,咖啡中添加減肥類化合物等[4],同時(shí)添加的形式和手段也由過(guò)去單一的較大量添加變成混和的較少量添加,或添加某種藥物的先導(dǎo)化合物或者改造物[5],單一的某種藥物不足以對(duì)人體造成傷害,但多種相同效果的藥物同時(shí)作用會(huì)對(duì)人體造成相同甚至更嚴(yán)重的傷害[6]。由于缺乏快速有效的檢測(cè)方法,食品中非法添加化合物的檢測(cè)面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

國(guó)內(nèi)關(guān)于解熱鎮(zhèn)痛效果化合物的檢測(cè),前期的主要依據(jù)是補(bǔ)充檢驗(yàn)方法《抗風(fēng)濕類中成藥補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2009025》,其主要針對(duì)中成藥,能檢測(cè)的化合物僅有13個(gè),需要分幾個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)分別進(jìn)行定性和定量檢測(cè),分析方法繁瑣、效率低、檢測(cè)種類有限。因此,研究出一種應(yīng)用范圍更廣、檢測(cè)化合物更多、更易操作的關(guān)于食品中非法添加的具有解熱鎮(zhèn)痛效果化合物的檢測(cè)方法尤為重要。目前非法添加檢測(cè)的手段主要有薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8,9]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-15]、液相色譜-核磁聯(lián)用法[16]等。其中超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法最為普遍,該方法可實(shí)現(xiàn)同時(shí)定性定量,高靈敏度檢測(cè),并且適用性強(qiáng),適于推廣。

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,以茶葉、代用茶和飲料作為基質(zhì),建立了一種快速、有效檢測(cè)食品中63種非法添加化合物的分析方法,為以后食品中非法添加化合物的分析測(cè)定奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀和Agilent 6460四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司); XS105電子分析天平(瑞士Mettler公司); AS20500B超聲清洗機(jī)(天津Auto science公司); MS3 digital渦旋儀(德國(guó)IKA公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

曲安西龍(triamcinolone)、潑尼松龍(predni-solone)、氫化可的松(hydrocortisone)、潑尼松(prednisone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、氟米松(flumethasone)、倍氯米松(beclomethasone)、氫化可的松醋酸酯(hydrocortisone acetate)、地夫可特(deflazacort)、甲基潑尼松龍醋酸酯(methylprednisolone acetate)、曲安奈德醋酸酯(triamcinolone acetonide acetate)、倍他米松戊酸酯(betamethasone valerate)、哈西奈德(halcinonide)、安西奈德(amcinonide)、美洛昔康(meloxicam)、雙氯芬酸鈉(diclofenac)、對(duì)乙酰氨基酚(paracetamol)、保泰松(phenylbutazone)、吡羅昔康(piroxicam)、甲氧芐啶(trimethoprim)、氨基比林(aminophenazone)、地西泮(diazapam)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、羅通定(rotundine)、舒林酸(sulindac)、甲芬那酸(mefenamic acid)、安替比林(antipyrine)、異丙安替比林(propyphenazone)、非那西丁(phenacetin)、萘丁美酮(nabumetone)、苯海拉明(diphenhydramine)、磺胺甲惡唑(sulfametho-xazole)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、曲安西龍雙醋酸酯(triamcinolone diacetate)、氟氫縮松(flurandrenolide)、潑尼松龍醋酸酯(prednisolone acetate)、氟米龍(fluoromethalone)、倍他米松醋酸酯(betamethasone acetate)、地塞米松醋酸酯(dexamethasone acetate)、布地奈德(budesonide)、氫化可的松丁酸酯(hydrocortisone butyrate)、氟米龍醋酸酯(fluorometholone acetate)、氫化可的松戊酸酯(hydrocortisone valerate)、氟輕松醋酸酯(fluocinonide)、二氟拉松雙醋酸酯(diflurasone diacetate)、潑尼卡酯(prednicarbate)、阿氯米松雙丙酸酯(alclomethasone dipropionate)、莫米他松糠酸酯(mometasone furoate)、倍氯米松雙丙酸酯(beclometasone dipropionate)購(gòu)自美國(guó)藥典委員會(huì),可的松(cortisone)、氟氫可的松醋酸酯(fludrocortisone acetate)、潑尼松醋酸酯(prednisone acetate)、依托考昔(etoricoxib)購(gòu)自加拿大Toronto Research Chemicals公司,可的松醋酸酯(cortisone acetate)、曲安奈德(tramcinolone acetonide)、氯倍他索丙酸酯(clobetasol propionate)、倍他米松雙丙酸酯(betamethasone dipropionate)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司,氟替卡松丙酸酯(fluticasone propionate)、塞來(lái)昔布(celecoxib)、氯倍他松丁酸酯(clobetasone butyrate)購(gòu)自European Pharmacopoeia Reference Standard公司,以上化合物純度均大于97%。甲醇、乙腈和乙酸銨(色譜純,美國(guó)Fisher Scientific公司);甲酸銨(色譜級(jí),美國(guó)Fisher Scientific公司),甲酸(色譜級(jí),德國(guó)CNW公司)。所用水均為Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。樣品均購(gòu)自網(wǎng)絡(luò)。

1.2 對(duì)照溶液的配制

分別精密稱取上述對(duì)照品各10 mg,以甲醇溶解,在10 mL容量瓶中以甲醇定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的對(duì)照儲(chǔ)備液。分別精密移取安替比林、羅通定、氨基比林、保泰松、吡羅昔康、美洛昔康、苯海拉明、非那西丁、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、氯苯那敏、依托考昔、異丙安替比林、布地奈德、倍氯米松雙丙酸酯、倍他米松雙丙酸酯、潑尼卡酯、氟米龍醋酸酯、倍他米松戊酸酯、甲基潑尼松龍、曲安西龍雙醋酸酯、曲安奈德、氯倍他索丙酸酯、曲安奈德醋酸酯對(duì)照儲(chǔ)備液10 μL;舒林酸、對(duì)乙酰氨基酚、氟輕松醋酸酯、二氟拉松雙醋酸酯、氟替卡松丙酸酯、阿氯米松雙丙酸酯、地西泮、潑尼松龍醋酸酯、氫化可的松丁酸酯、安西奈德、莫米他松糠酸酯、氯倍他松丁酸酯、潑尼松龍、可的松、倍他米松、地塞米松、氫化可的松戊酸酯對(duì)照儲(chǔ)備液25 μL,氫化可的松、潑尼松、氟米松、倍氯米松、酮洛芬、氟米龍、地夫可特、氫化可的松醋酸酯、甲基潑尼松龍醋酸酯、潑尼松醋酸酯、可的松醋酸酯、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯、甲芬那酸對(duì)照儲(chǔ)備液50 μL,曲安西龍、氟氫縮松、氟氫可的松醋酸酯、哈西奈德、芬布芬、萘丁美酮、塞來(lái)昔布、雙氯芬酸對(duì)照儲(chǔ)備液250 μL,置于同一50 mL容量瓶中,以甲醇定容,配制成混合對(duì)照中間液。置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?數(shù)據(jù)采集時(shí)用甲醇稀釋至相應(yīng)的濃度。

1.3 樣品的制備

精密稱取研磨后混勻的代用茶、茶葉或搖勻的液體飲料1 g,置于50 mL量瓶中,加入甲醇約40 mL,渦旋2 min,超聲30 min,放冷至室溫,用甲醇定容至刻度,搖勻,過(guò)微孔濾膜(0.22 μm,尼龍膜),取濾液,供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.4 色譜條件

色譜柱:Thermo Acclaim RSLC C18(100 mm×2.1 mm, 2.2 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:2 μL;流動(dòng)相:A為5 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸), B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序:0～1 min, 5%B; 1～17 min, 5%B～37%B; 17～27 min, 37%B～85%B; 27～28 min, 85%B～95%B; 28～31 min, 95%B; 31～33 min, 95%B～5%B; 33～36 min, 5%B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:ESI;檢測(cè)方式:動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(dMRM);電離電壓:4.0 kv(正離子掃描);干燥氣流速:7 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;鞘氣流速:11 L/min;鞘氣溫度:350 ℃;霧化器流量:276 kPa。化合物定性、定量離子及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 63種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

Product ion 2: quantitative ion. CE: collision energy.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

研究考察了Thermo Accucore XL C18(100 mm×2.1 mm, 4 μm)、Thermo Acclaim RSLC C18(100 mm×2.1 mm, 2.2 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)3款色譜柱對(duì)待測(cè)化合物的分離效果。比較了0.1%乙酸-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%乙酸)-0.1%乙酸乙腈和5 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸乙腈3種流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響,并進(jìn)行了梯度優(yōu)化。結(jié)果表明,采用2.2 μm Thermo Acclaim RSLC C18柱,以5 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸乙腈進(jìn)行梯度洗脫時(shí),63種化合物的響應(yīng)值和峰形均較好,包括同分異構(gòu)體倍他米松和地塞米松在內(nèi)的63種化合物均可獲得較好的分離。

在ESI+模式下對(duì)0.3 μg/L的63種化合物混合對(duì)照溶液進(jìn)行質(zhì)譜掃描分析,得到每種化合物的分子離子峰[M+H]+,以分子離子峰為母離子,對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,優(yōu)化每種化合物母離子和子離子所需的毛細(xì)管出口電壓和碰撞能量,優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。63種化合物在優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜條件下分離效果較好,靈敏度較高,63種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.3 μg/L)的總離子流色譜圖見圖1。

圖 1 63種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.3 μg/L)的總離子流色譜圖

2.2 前處理方法的優(yōu)化

在前期研究中,最先嘗試有機(jī)試劑超聲提取的方法,但發(fā)現(xiàn)出峰時(shí)間靠前的甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚、氨基比林等化合物的回收率偏低(20%～40%),為解決這些化合物回收率偏低的問題,將梯度放緩,采集時(shí)間延長(zhǎng)至35 min,緩解了63種化合物與基質(zhì)共流出的問題,從而使保留時(shí)間靠前的化合物的回收率有明顯改善?？疾炝思状肌⒁译?、50%甲醇和80%甲醇的提取效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種溶劑提取后,各化合物的回收率無(wú)顯著差異,且甲醇提取回收率更接近理論值,詳見圖2。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性樣品的提取比較,結(jié)果無(wú)明顯差異?？紤]操作方便、成本、環(huán)保和對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的健康影響(乙腈毒性比甲醇大)等因素,選擇甲醇作為提取溶劑。

圖 2 4種提取溶劑對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

研究主要針對(duì)飲料、茶葉及相關(guān)制品類成分復(fù)雜的食品,該類產(chǎn)品可能存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),而基質(zhì)效應(yīng)(ME)主要是由于樣品在離子化時(shí)基質(zhì)成分與目標(biāo)化合物相互競(jìng)爭(zhēng)電離所致,包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。采用ME=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%的計(jì)算方法對(duì)63種化合物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。一般來(lái)說(shuō),當(dāng)ME在80%～120%之間時(shí),表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯,在實(shí)際檢測(cè)中可忽略不計(jì);反之則應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響,在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。由表2可知,各基質(zhì)中ME在80%～120%之間的化合物所占比例為:茶葉56%(35/63)、代用茶59%(37/63)、飲料79%(50/63),說(shuō)明茶葉和代用茶基質(zhì)效應(yīng)更為明顯;部分化合物檢測(cè)會(huì)受到基質(zhì)效應(yīng)的影響。為了能更準(zhǔn)確地測(cè)定目標(biāo)化合物,本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍

在GB 5009.1-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品理化檢驗(yàn)方法總則》征求意見稿中,定量限定義為樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低限,其測(cè)定結(jié)果應(yīng)滿足該最低量時(shí)準(zhǔn)確度和精密度要求。在保證準(zhǔn)確定性的前提下,通過(guò)使用空白基質(zhì)逐級(jí)稀釋對(duì)照品溶液來(lái)考察定量限,最終在保證線性良好、精密度<15%、絕大部分化合物回收率在80%～120%的前提下,63個(gè)化合物的定量限為0.10～2.50 mg/kg,詳見表2。

配制63種化合物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用空白樣品基質(zhì)提取液配制系列基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在已優(yōu)化的色譜與質(zhì)譜條件下,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以峰面積(y)與相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(x, μg/L)作圖,并計(jì)算各待測(cè)物線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),63種化合物的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上,具體線性關(guān)系參數(shù)見表2。

表 2 63種化合物在純?nèi)軇┖?種不同基質(zhì)中的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)和定量限

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.4.2準(zhǔn)確度、重復(fù)性和進(jìn)樣精密度

以3種食品基質(zhì)飲料、茶葉及代用茶作為代表基質(zhì),進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。按照定量限的1、2、5倍進(jìn)行添加水平試驗(yàn),各水平制樣6份。以測(cè)出量對(duì)理論添加量的百分比值計(jì)算平均回收率;每水平進(jìn)行了6次平行實(shí)驗(yàn),以測(cè)出量的RSD表示方法重復(fù)性;取2倍定量限水平的樣品連續(xù)進(jìn)樣6針,以測(cè)出量的RSD表示進(jìn)樣精密度。由表3可知,63種化合物各添加水平平均回收率為62.4%～129.4%,重復(fù)性、進(jìn)樣精密度的RSD值為0.3%～9.6%,方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性和精密度均基本滿足定量分析的要求。

表 3 3種基質(zhì)中63種化合物的回收率、進(jìn)樣精密度和重復(fù)性(n=6)

表 3 (續(xù))

表 3 (續(xù))

表 3 (續(xù))

2.4.3穩(wěn)定性

分別配制茶葉、代用茶和飲料3種基質(zhì)的低水平加標(biāo)溶液1份,放置0、1、2、4、8、12和24 h后分別進(jìn)行測(cè)定,以峰面積計(jì)算63種化合物在3種基質(zhì)中0～12 h和0～24 h的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD,在12 h內(nèi),3種基質(zhì)中63種化合物的RSD均<15%; 24 h時(shí)涼茶飲料基質(zhì)中部分化合物(5/63)的RSD普遍增高(≥20%)。結(jié)果說(shuō)明,在12 h內(nèi),3種基質(zhì)供試品溶液的穩(wěn)定性滿足定量分析的要求。

2.4.4實(shí)際樣品的測(cè)定

利用建立的方法,對(duì)網(wǎng)上宣稱具有解熱鎮(zhèn)痛作用的83批代用茶和涼茶飲料進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品8批次,詳細(xì)結(jié)果見表4。

表 4 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

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3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)茶葉、代用茶和飲料中63種化合物的分析方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單,分析速度快,靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,能滿足同時(shí)測(cè)定食品中63種化合物的要求。該方法已經(jīng)被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局收錄為補(bǔ)充檢驗(yàn)方法,有望在食品非法添加物的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。