改良QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速檢測(cè)茶葉中95種除草劑殘留

張 蓉, 劉 鑫, 彭 媛, 劉韋華, 張立承, 代 瑩, 李莎莎, 高志賢*

(1. 中華人民共和國(guó)北京海關(guān), 北京 100026; 2. 天津環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所, 天津 300050)

中國(guó)以歷史悠久的茶文化聞名世界,茶葉的種植與加工是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要領(lǐng)域之一,在茶園中雜草與茶樹爭(zhēng)奪養(yǎng)分和生存空間,造成茶樹減產(chǎn)和品質(zhì)下降,研究表明成年茶園秋季雜草可達(dá)94種、分屬41科81屬[1],而化學(xué)除草、生物除草、人工除草、茶園鋪草等是目前常用的幾種除雜草措施[2],其中化學(xué)除草劑以其成本低、防治效果好而成為防治雜草的主要方法。由于雜草的多樣性,針對(duì)茶園雜草的品種,選擇多種除草劑進(jìn)行輪換施藥及綜合防治是較為通行的辦法[3],但也會(huì)造成除草劑在土壤、水源和農(nóng)作物中的殘留。研究表明,三嗪類除草劑可能引起新生兒缺陷、患癌和內(nèi)分泌干擾[4],莠去津[5]、甲草胺[6]、乙草胺[7]更被明確報(bào)道具有毒性，可干擾人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)。因此,茶葉中多種除草劑的同時(shí)檢測(cè)對(duì)保障茶葉飲用安全具有重要意義。

目前,實(shí)驗(yàn)室中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)可采用氣相色譜法(GC)[8]、液相色譜法(LC)[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[10,11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12,13]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[14,15]等,氣相色譜法和液相色譜法由于待測(cè)物必須與檢測(cè)器的選擇性相適應(yīng)，很難完成多種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)。因此色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法成為農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的主流方法。高分辨質(zhì)譜通過(guò)精確的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定性定量檢測(cè),可降低復(fù)雜樣品基質(zhì)檢測(cè)中的假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn),近幾年被廣泛用于農(nóng)藥多殘留分析領(lǐng)域中。同時(shí),高分辨質(zhì)譜的高掃描速度和靈敏度也保證了多種痕量農(nóng)藥殘留在復(fù)雜基質(zhì)中的同時(shí)檢出[16,17]。

經(jīng)典QuEChERS法主要應(yīng)用于蔬菜、水果等含水量多、基質(zhì)干擾少的基質(zhì)[18,19],對(duì)于茶葉等復(fù)雜基質(zhì)的前處理凈化效果較差,應(yīng)用石墨化炭黑(GCB)吸附色素又會(huì)降低平面結(jié)構(gòu)化合物的回收率。近年來(lái)多壁碳納米管(MWCNTs)被引入農(nóng)殘檢測(cè)前處理中,并展現(xiàn)出優(yōu)異特性[20-24]。

本文以綠茶、紅茶等常見(jiàn)茶葉為樣品基質(zhì),采用改良的QuEChERS前處理技術(shù)凈化樣品,結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS),建立了快速、準(zhǔn)確檢測(cè)茶葉中95種常見(jiàn)除草劑殘留的定性定量分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜儀Ultimate 3000 RSLC、四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q Exactive Orbitrap和Xcalibur工作站(美國(guó)Thermo Scientific公司);分析天平SQP(德國(guó)Sartorius公司,感量10 mg)和XPE205DR(瑞士Mettler Toledo公司,感量0.01 mg);離心機(jī)Universal 320R(德國(guó)Hettich公司)和Sigma 1-14(德國(guó)Sartorius公司);超聲波清洗器Sonorex Digitec(德國(guó)Bandelin公司);氮吹儀DTU-2BN(日本Taitec公司);移液器(德國(guó)Eppendorf公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);旋渦混勻器MS 3 Digital(德國(guó)IKA公司)。

乙腈、甲醇、甲苯、醋酸銨(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;甲酸(色譜純)購(gòu)自北京邁瑞達(dá)科技有限公司;冰乙酸(色譜純)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無(wú)水乙酸鈉(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水硫酸鎂(分析純)購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。95種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

QuEChERS吸附劑:GCB(100～400目,德國(guó)CNW公司);N-丙基乙二胺(PSA, 40～60 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司); MWCNTs(20～40 nm,純度>90%,北京博宇高科新材料技術(shù)有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg,用甲苯定容至10 mL,配制成單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再用乙腈配制成適量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(具體濃度見(jiàn)表1),于4 ℃冰箱保存。

準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、2.5、5.0、10.0和25.0 μL,用空白基質(zhì)提取液定容至1 mL,得到相應(yīng)濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

稱取粉碎后的茶葉樣品5.0 g,置于50 mL離心管中,加入10 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈-甲苯(9∶1, v/v)溶液、1.5 g無(wú)水乙酸鈉和3.0 g無(wú)水硫酸鎂,混勻,超聲提取10 min,以6 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,轉(zhuǎn)移至含150 mg無(wú)水硫酸鎂、150 mg PSA、12.5 mg MWCNTs和12.5 mg GCB的凈化管中,劇烈振搖1 min,以10 000 r/min離心10 min,用0.2 μm針筒式過(guò)濾器過(guò)濾,待上機(jī)測(cè)定。

1.4 分析條件

色譜柱:Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm);柱溫:45 ℃;樣品室溫度:5 ℃;流動(dòng)相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液(含4 mmol/L乙酸銨);流動(dòng)相B: 0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液(含4 mmol/L乙酸銨);流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～8.0 min, 12%B～95%B; 8.0～9.0 min, 95%B～100%B; 9.0～11.0 min, 100%B; 11.0～11.1 min, 100%B～12%B; 11.1～14.0 min, 12%B。進(jìn)樣量10 μL。

鞘氣流速:4.55 L/min (35 arb);輔助氣流速:3 L/min (10 arb);反吹氣流速:0 L/min (0 arb);噴霧電壓:3.50 kV;毛細(xì)管溫度:320 ℃;管狀透鏡電壓:50.0 V;輔助氣加熱溫度:350 ℃;運(yùn)行時(shí)間:14 min;極性模式:正/負(fù);包含模式:開。全掃描參數(shù):分辨率,70 000;自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)(AGC target), 1×106;最大離子注入時(shí)間(maximum IT), 250 ms;掃描范圍,m/z100～700。數(shù)據(jù)依賴二級(jí)質(zhì)譜掃描參數(shù)(data-dependent MS2, dd-MS2):分辨率,35 000;自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù),2×105;最大離子注入時(shí)間,120 ms;循環(huán)次數(shù)(loop count), 5;隔離寬度(isolation width),m/z4.0;歸一化碰撞能量(NCE), 20、40和60。95種除草劑質(zhì)譜掃描的母離子信息見(jiàn)表1。

表 1 95種除草劑的母離子、保留時(shí)間及其在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的含量

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

參考Wang等[17]的方法,優(yōu)化了液相色譜條件。在1.4節(jié)色譜條件下,95種除草劑在4～10 min內(nèi)分布均勻,以保留時(shí)間較前、居中和較后的二丙烯草胺、快敵蜱、稗草畏為例,其一級(jí)全掃描色譜峰峰形對(duì)稱,有利于定量分析(見(jiàn)圖1)。

圖 1 (a)二丙烯草胺、(b)快敵蜱、(c)稗草畏(0.1 mg/L)的提取離子色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對(duì)每種除草劑的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，并采用全掃描和自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜(Full MS/dd-MS2)模式,得到每種化合物的母離子提取離子色譜圖和二級(jí)碎裂質(zhì)譜圖,選取色譜峰頂端掃描點(diǎn)的質(zhì)量數(shù)作為母離子實(shí)際質(zhì)量數(shù),選擇至少2個(gè)具有代表性的二級(jí)離子作為定性離子。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),掃描時(shí)一些信號(hào)較低或是母離子和保留時(shí)間都相近的化合物的二級(jí)質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)較低。分析原因可能是化合物自身母離子裂解較弱,或是母離子質(zhì)荷比相近的化合物相互影響了二級(jí)裂解的效果。

圖 2 3種掃描模式下非草隆(10 μg/L)的提取離子色譜圖和產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖

圖 3 3種掃描模式下草乃敵與異惡草松產(chǎn)物離子的質(zhì)譜圖

為提高質(zhì)譜掃描效率,將所有待測(cè)化合物的母離子精確質(zhì)量數(shù)輸入包含列表(inclusion list),并將其保留時(shí)間±1.5 min區(qū)間作為掃描時(shí)間段,使質(zhì)譜有針對(duì)性的掃描和裂解,從而提高化合物二級(jí)質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)度。以0.01 mg/L的非草隆為例(見(jiàn)圖2),其母離子(m/z165.102 24)提取離子色譜圖的信號(hào)在“不開啟包含列表(nolist)”、“開啟包含列表(list)”和“開啟包含列表并限定離子掃描時(shí)間范圍(list+rt)”3種模式下強(qiáng)度相當(dāng),但是采用了“l(fā)ist+rt”模式的二級(jí)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度是“nolist”模式下的2倍,且雜峰明顯較低。

又如草乃敵與異惡草松,二者母離子的m/z接近,保留時(shí)間均為7.5 min,采用“l(fā)ist+rt”掃描方式時(shí),二級(jí)質(zhì)譜的響應(yīng)信號(hào)提高了5倍(見(jiàn)圖3)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)目標(biāo)化合物濃度較低、信號(hào)較弱時(shí),保留時(shí)間和母離子質(zhì)荷比相近的化合物會(huì)彼此干擾二級(jí)裂解,因此,通過(guò)啟用包含列表,縮小掃描范圍,可以使目標(biāo)化合物在現(xiàn)有條件下得到盡可能多的數(shù)據(jù)點(diǎn),并產(chǎn)生足夠觸發(fā)二級(jí)裂解的母離子豐度,從而得到更準(zhǔn)確的定性定量結(jié)果,避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

2.3 QuEChERS前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

MWCNTs是一種新型的納米材料,具有獨(dú)特的理化性能和較大的比表面積,由于MWCNTs呈管狀結(jié)構(gòu),在吸附特性上與傳統(tǒng)的GCB吸附劑具有一定的差異,本方法在AOAC 2007.01方法的基礎(chǔ)上考察了MWCNTs與GCB的加入對(duì)凈化效果及回收率的影響。同時(shí)，考慮到GCB對(duì)平面化合物回收率的影響,在酸化乙腈中加入了少量甲苯。為提高方法的驗(yàn)證效率,設(shè)計(jì)了三因素三水平正交試驗(yàn)(見(jiàn)表2),根據(jù)碳吸附劑的不同進(jìn)行3組三水平正交實(shí)驗(yàn),在3組試驗(yàn)中碳吸附劑分別為GCB、MWCNTs和GCB-MWCNTs(1∶1,質(zhì)量比)。以95個(gè)農(nóng)藥加標(biāo)回收率在80%～120%之間的農(nóng)藥個(gè)數(shù)來(lái)衡量實(shí)驗(yàn)結(jié)果,3組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本相同,采用組合2、3、4、5、7進(jìn)行前處理時(shí),有60多種農(nóng)藥具有較好的回收率;凈化后組合6、8、9的凈化液完全無(wú)色,而組合4、5、7的凈化液呈淡黃色。綜合考慮回收率、色素清除效果等因素,最終選定組合5(12.5 mg GCB、12.5 mg MWCNTs、150 mg PSA、乙腈-甲苯(9∶1, v/v))作為最終的前處理?xiàng)l件。由表2對(duì)比極差(R)發(fā)現(xiàn),對(duì)回收率影響的順序?yàn)榧妆奖壤?碳吸附劑使用量>PSA使用量,甲苯的加入降低了含有苯環(huán)等平面結(jié)構(gòu)的化合物在碳吸附劑上的吸附,從而顯著提高了回收率。

實(shí)驗(yàn)還對(duì)比了添加10 mL水浸潤(rùn)后提取和直接提取兩種模式對(duì)凈化效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),前者凈化后,提取液顏色明顯較后者深,但是二者的回收率沒(méi)有明顯差異。因此直接用提取液進(jìn)行提取后凈化上機(jī)。

表 2 三水平正交實(shí)驗(yàn)

Carbon sorbent included graphitized carbon black (GCB), multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) and GCB-MWCNTs (1∶1, mass ratio), respectively. PSA: primary secondary amine;K: the sum of results in each level;k=K/3;R=kmax-kmin.

2.4 線性范圍、回收率和精密度

為消除基質(zhì)效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)采用陰性樣品基質(zhì)(綠茶)提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,并對(duì)其進(jìn)行分析,以各除草劑的質(zhì)量濃度(X, μg/L)和對(duì)應(yīng)的峰面積(Y)繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到的線性方程和相關(guān)系數(shù)(r)見(jiàn)表3。結(jié)果表明,在5～250 μg/L線性范圍內(nèi),95種除草劑線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.99,能夠滿足分析要求。

對(duì)綠茶樣品進(jìn)行3個(gè)水平添加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果表明,95種除草劑平均回收率為63.3%～129.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%～15.2%,能夠滿足分析要求。

表 3 95種除草劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表 3 (續(xù))

Low, medium and high spiked levels: 50, 250 and 500 μg/kg for 2,4-DB acid, allidochlor, benoxacor, bromacil, diallate, flumiclorac-pentyl, fluridone, monalide, mo-nolinuron, monuron, nitralin, norflurazon, quinoclamine, triallate, vernolate; 20, 100 and 200 μg/kg for oryzalin; 100, 500 and 1000 μg/kg for diflufenican; 10, 50 and 100 μg/kg for the other herbicides.Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

圖 4 (a)茶葉樣品和(b)標(biāo)準(zhǔn)品中地樂(lè)酚的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

在市場(chǎng)上采購(gòu)綠茶10份、茉莉花茶10份、烏龍茶10份、鐵觀音10份,經(jīng)本方法進(jìn)行篩查,檢出11個(gè)樣品含有地樂(lè)酚,含量為26.2～44.0 μg/kg。將實(shí)際樣品中地樂(lè)酚的二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品中地樂(lè)酚的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比(見(jiàn)圖4),可以看出,實(shí)際樣品中地樂(lè)酚母離子的m/z為239.066 62,兩個(gè)主要子離子的m/z為194.045 09和207.040 37,均與標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)離子吻合,且質(zhì)量偏差在5×10-6內(nèi)。經(jīng)與《茶葉中448種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)方法(GB 23200.13-2016)對(duì)比,本方法定量結(jié)果的精密度小于10%,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性滿足定量檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

本方法根據(jù)茶葉基質(zhì)的特點(diǎn),結(jié)合多壁碳納米管，對(duì)QuEChERS前處理方法進(jìn)行了改良,并依托高分辨質(zhì)譜建立了常見(jiàn)95種除草劑的定性定量檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便,節(jié)省溶劑,定性定量準(zhǔn)確,適用于茶葉等復(fù)雜樣品基質(zhì)中多種除草劑的高通量同時(shí)檢測(cè)。