超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定熱帶水果中殺蟲雙殘留

林 濤, 邵金良, 劉興勇, 王 靜, 鄒艷虹, 李茂萱, 劉宏程*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所， 云南 昆明 650205; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估 實驗室(昆明)， 云南 昆明 650205; 3. 云南省保山市龍陵縣農(nóng)產(chǎn)品質量安全檢驗檢測站， 云南 龍陵 678300)

殺蟲雙是沙蠶毒素類殺蟲劑中的代表農(nóng)藥,屬有機氮類農(nóng)藥,對外界的害蟲具有觸殺和胃殺作用,主要用于甘蔗中蠐螬、螟蟲等蟲害的防治[1]。近年來,因其殺蟲效果好、毒性相對較低而廣泛應用于其他果蔬種植過程中蟲害的防治[2-4]。殺蟲雙對人畜的毒性屬于中等毒性,對水生生物毒性較低[5,6],對家蠶和蜜蜂的毒性較大[7],而殺蟲雙具有較強的內吸作用,相對于其他觸殺性和保護性農(nóng)藥,可能會大量的殘留于作物體內,隨著食物鏈進入人體蓄積。然而,國內外很少有關于殺蟲雙的限量標準,僅我國的農(nóng)藥殘留限量標準GB 2763-2016規(guī)定了大米、小麥、玉米、鮮食玉米中殺蟲雙的限量值,而甘藍、蘋果和甘蔗中的限量值僅為臨時限量,所涉及的作物種類較少,在蘋果和甘蔗中的限量值為0.1 mg/kg,其余作物均為0.2 mg/kg以上。

殺蟲雙在酸性條件下穩(wěn)定,在堿性條件下易降解為沙蠶毒素,現(xiàn)有的國家標準GB 2763-2016推薦了測定殺蟲雙的唯一方法(GB/T 5009.114-2003),就是將殺蟲雙在堿性條件下降解為沙蠶毒素并對其進行定量分析,然而該方法只針對大米中殺蟲雙的殘留量,且方法操作步驟較多,需要靜置過夜降解,耗時費力,靈敏度較差。近年來,大部分的測定方法也是將殺蟲雙降解為沙蠶毒素并結合氣相色譜法[8,9]或氣相色譜-質譜聯(lián)用法[10]進行測定;也有相關文獻[11,12]采用液相色譜法對殺蟲雙進行測定,但是靈敏度較低,無法滿足現(xiàn)代分析測定的要求。隨著三重四極桿質譜的廣泛應用,也有利用液相色譜-串聯(lián)質譜法測定殺蟲雙的文獻報道[3,13],但是這些方法采用甲醇水溶液作為提取劑,提取溶液中成分較多,對于后續(xù)的質譜測定存在一定干擾,同時由于殺蟲雙極性較大,常規(guī)的C18色譜柱對其保留較差,出峰時間較早,溶劑及雜質干擾可能較大。

目前,熱帶水果中也經(jīng)常使用殺蟲雙進行田間防護[14],但熱帶水果中的糖分較高,水溶性色素較多,采用甲醇水溶液提取時，提取液中會包含糖分和色素等干擾物,從而影響殺蟲雙的定性和定量分析。因此,尋求快捷簡便的提取凈化方法以及較優(yōu)的色譜分離條件是目前測定熱帶水果中殺蟲雙殘留的首要任務。本研究以熱帶水果為研究對象,以殺蟲雙為目標農(nóng)藥,對QuEChERS方法進行改進,針對樣品前處理、色譜分離、質譜電離等方面進行系統(tǒng)討論,旨在提高殺蟲雙檢測的靈敏度和準確度。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API 4000三重四極桿串聯(lián)質譜儀(美國AB Sciex公司); 1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司);LP渦旋振蕩器(美國Thermo Scientific公司); BSA124S電子分析天平(德國Sartorius公司); TGL-15B高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠); Hei-VAP Value Digital旋轉蒸發(fā)儀(德國海道夫公司)。

乙腈、甲醇(色譜純,德國Merck公司);檸檬酸氫二鈉(純度99%)、乙酸和甲酸(色譜純)(美國Sigma公司);無水乙酸鈉、氯化鈉、乙酸銨(分析純,國藥集團化學試劑有限公司); ProElut C18、N-丙基乙二胺(PSA)、NH2和Florisil填料(粒徑50 μm,中國迪馬科技公司);純凈水(杭州娃哈哈公司);殺蟲雙(100 mg/L,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所)。

1.2 試驗方法

1.2.1標準溶液的配制

用甲醇將殺蟲雙標準品稀釋為10 mg/L的標準儲備液;再吸取0.1 mL標準儲備液,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至10 mL,混勻得到0.1 mg/L的標準溶液,于低溫避光保存。

1.2.2樣品前處理

準確稱取5.00 g經(jīng)勻漿后的熱帶水果樣品,置于50 mL離心管中,加入10 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液和5.0 g NaCl,渦旋提取5 min后,以5 000 r/min離心5 min,然后移取上層乙腈,置于旋蒸瓶中,再加入10 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液,重復提取一次,合并乙腈層,旋轉蒸發(fā)儀蒸干后加入2 mL乙腈復溶,轉移至50 mL離心管中,加入200 mg PSA、100 mg C18、300 mg MgSO4和500 mg檸檬酸氫二鈉,渦旋振蕩提取10 s,以5 000 r/min離心5 min后,取上層提取液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,待分析。

1.2.3色譜條件

色譜柱:CAPCELL CORE PC親水色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm,日本Shiseido公司);柱溫:35 ℃;流動相:乙腈-水(95∶5, v/v);等度洗脫;流速:200 μL/min;進樣量:5 μL。

1.2.4質譜條件

離子源為ESI源,負離子掃描模式;氣簾氣流速為20 L/h;霧化氣流速為55 L/h;輔助氣流速為55 L/h;輔助加熱氣溫度為550 ℃;噴霧電壓為-5 500 V;多反應監(jiān)測(MRM)模式;定量離子對(m/z)為310.0>229.8;定性離子對(m/z)為310.0>185.0;去簇電壓分別為-30 V和-30 V;碰撞電壓分別為-15 V和-25 V。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

本研究以0.1 mg/L殺蟲雙為研究對象,首先在正離子模式下對其進行質譜條件的研究,結果表明殺蟲雙在正離子模式下響應較差,因此采用負離子模式對其進行質譜條件的優(yōu)化。參照文獻[13]中的離子對信息,分別優(yōu)化相關的離子對條件和電壓。圖1為殺蟲雙電離及裂解的原理圖,可以看出,殺蟲雙中S-S鍵極易斷裂,而C-N鍵也較易斷裂,可分別形成兩個強度較高的子離子碎片。

圖 1 殺蟲雙質譜裂解原理圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

殺蟲雙結構中含有雙硫代磺酸鈉基丙烷取代基,極性較大,在常規(guī)ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)上的保留較差,采用乙腈-水(95∶5, v/v)等度洗脫時,出峰時間較早(0.62 min),因此本研究采用CAPCELL CORE PC親水色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm),可達到較好的保留效果,采用乙腈-水(95∶5, v/v)等度洗脫時,殺蟲雙在1.85 min出峰,且峰形較好,響應較C18色譜柱高(見圖2)。

圖 2 采用不同色譜柱時殺蟲雙的色譜圖

2.3 凈化方法的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

殺蟲雙可溶于甲醇、乙腈和二甲亞砜等溶劑,在丙酮和乙醇乙酯中的溶解度較小。本文比較了甲醇和乙腈對于殺蟲雙的提取效果,結果表明,甲醇和乙腈對殺蟲雙的提取效率相當,但是甲醇的極性較乙腈大,提取液中常含有極性較大的干擾物,因此選擇乙腈作為提取溶劑,同時采用了二次提取的方式,以增加殺蟲雙的提取率。二次提取后殺蟲雙的總提取率在80%以上,達到了較好的提取效果。

實驗同時考察了乙酸的加入對提取效率的影響。第一次提取時,乙酸的加入對于提取率沒有太大變化,均為50%,但是第二次提取時,不加乙酸,提取率只有10%左右,而加入乙酸后,提取率能夠達到30%左右。這可能是因為乙酸的加入能夠保持提取過程中溶液的酸性,抑制殺蟲雙在提取過程中的降解。綜合以上,選取含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液作為提取溶劑。

2.3.2凈化填料的選擇

PSA、C18、NH2和Florisil作為目前常見的凈化材料,廣泛應用于農(nóng)藥殘留檢測中[15-18]。本研究分別比較了這幾種填料對于殺蟲雙的凈化效果。結果表明,NH2和Florisil對于殺蟲雙的凈化效果一般;PSA的加入能夠有效減小基質效應,特別是對一些糖分較高的熱帶水果,同時C18對于基質中極性較小的化合物能夠有效吸附,從而提高凈化的總體效果。綜合比較,選擇PSA和C18作為混合凈化填料。

采用2 mL樣品提取液,比較了不同含量組合的PSA和C18(50 mg-250 mg、100 mg-200 mg、150 mg-150 mg、200 mg-100 mg、250 mg-50 mg)的凈化效果。結果表明,當PSA含量較低時,對雜質的吸附能力較弱,樣品基質效應較大,而當PSA含量較高時,對雜質的吸附較強,凈化效果較好,但是對殺蟲雙同樣存在一定吸附。低含量的C18對于基質中極性較小的化合物吸附不夠,在質譜分析時易造成干擾。綜合考慮,選擇200 mg PSA和100 mg C18進行吸附凈化。

2.3.3緩沖鹽的選擇

在提取凈化時,常加入緩沖鹽以保證提取過程中溶液酸堿性的穩(wěn)定[19,20]。殺蟲雙在酸性條件下穩(wěn)定、堿性條件下不穩(wěn)定,但是其在強酸和強堿環(huán)境下易降解。因此,本研究為了保證殺蟲雙在提取過程中不發(fā)生降解,分別比較了添加乙酸鈉和檸檬酸氫二鈉兩種常見緩沖鹽的提取效果。結果表明,乙酸鈉的加入,使殺蟲雙的提取率下降,當采用檸檬酸氫二鈉作緩沖體系時,殺蟲雙的提取率較好,明顯高于乙酸鈉緩沖體系。這可能是因為乙酸鈉體系的pH值為5～6[21],而檸檬酸氫二鈉體系的pH值為4～5,使殺蟲雙在提取過程中更穩(wěn)定性。

實驗同時比較了檸檬酸氫二鈉的添加量(100、300、500、700和900 mg)對提取效果的影響。結果表明,殺蟲雙的提取效率隨檸檬酸氫二鈉添加量的增大而逐漸增大,當添加量為500 mg時達可到較好的提取效果;繼續(xù)增大檸檬酸氫二鈉的添加量,提取效率呈下降趨勢。這可能是因為檸檬酸氫二鈉含量較低時不能完全維持體系的酸性,殺蟲雙會少量降解,但是當添加量較多時可能會對殺蟲雙部分吸附,從而影響提取效率。

2.4 線性范圍和檢出限

對0.1、0.5、2.5、5.0和10.0 μg/L殺蟲雙標準溶液進樣分析,分別以峰面積對各質量濃度進行線性回歸。結果表明,殺蟲雙在0.1～10.0 μg/L范圍內線性關系良好,相關系數(shù)(r2)為0.999 3。

選取空白熱帶水果基質,加入適當濃度的殺蟲雙,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)對應的加標水平為檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。結果表明,檢出限和定量限分別為0.015 μg/kg和0.05 μg/kg,符合農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測的要求。

表 1 殺蟲雙的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

2.5 回收率和精密度

本實驗采用空白火龍果、菠蘿和芒果3種近年來我國進出口貿易量較大的水果作為代表基質,以LOQ、5倍LOQ和10倍LOQ作為添加水平進行加標回收試驗和精密度測定,通過6次平行試驗的結果計算平均回收率和相對標準偏差(見表1)。結果表明,殺蟲雙的回收率為81.0%～88.3%,相對標準偏差范圍為3.9%～6.2%。

3 結論

本文利用改進的QuEChERS方法,直接提取凈化熱帶水果中的殺蟲雙,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜快速測定殺蟲雙殘留的方法,快速完成熱帶水果中殺蟲雙的定性和定量分析。該法準確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留測定要求,與傳統(tǒng)方法相比,極大縮短了前處理時間,提高了檢測靈敏度。