轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選安徽烏菜與普通白菜的差異表達(dá)基因

王明霞 田紅梅 江海坤 賈 利 王 艷 方 凌 *

（1安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，安徽合肥 230031；2園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)安徽省重點實驗室，安徽合肥 230031）

烏 塌 菜〔Brassica campestrisL. ssp.chinensis（L.）Makinovar.rosularisTsen et Lee〕別名塌菜、塌棵菜、黑菜等，2n=20，是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個變種，起源于南北氣候區(qū)之間。安徽烏菜是烏塌菜的一種，其植株形態(tài)介于普通白菜與大白菜之間，是安徽省的著名特色蔬菜之一，具有很多優(yōu)良性狀和獨特的商品性，如抗寒性、抗病性、耐抽薹、葉面皺泡、口感與風(fēng)味等，對作物遺傳改良及研究白菜類的進(jìn)化與分化具有重要價值，是寶貴的種質(zhì)資源（李曙軒，1990）。曹家樹和曹壽椿（1995）認(rèn)為環(huán)境條件決定著植物演化的方向，中國白菜各類群的變異主要是葉部性狀的變化，從葉片等性狀入手探討其演化關(guān)系是有意義的。葉面上有皺泡是安徽烏菜區(qū)別于其他白菜亞種的一個典型特征，前期生產(chǎn)實踐表明，皺泡多而密的安徽烏菜耐寒性較強(qiáng)，商品性好。但是，目前對安徽烏菜形態(tài)變異的分子機(jī)制知之甚少，這在很大程度上妨礙了對安徽烏菜葉部形態(tài)發(fā)生過程的深入了解，使許多生產(chǎn)上的現(xiàn)象無法得到正確的解釋和證實。為了研究安徽烏菜與普通白菜葉部形態(tài)上的差異，本試驗擬在轉(zhuǎn)錄組水平上研究安徽烏菜與普通白菜的差異表達(dá)基因，揭示其轉(zhuǎn)錄組序列水平和轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量水平的變異，發(fā)掘安徽烏菜葉部形態(tài)變異的轉(zhuǎn)錄組差異和分子機(jī)制，為安徽烏菜基因挖掘和進(jìn)一步開發(fā)優(yōu)異性狀材料提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，同時也為研究白菜類蔬菜進(jìn)化及性狀建成機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所自育的普通白菜自交系C-14-007、安徽烏菜自交系黃心烏1408和黑心烏1422為試材，2016年9月在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所試驗地進(jìn)行播種，播后30 d定植，定植前每667 m2施腐熟有機(jī)肥3 000～4 000 kg、三元復(fù)合肥（N-P-K為17-8-20）25～30 kg，深翻耙平后做畦。當(dāng)?shù)?5片葉展開時，選取生長發(fā)育一致的植株，取第15片葉迅速放入液氮中，每份材料取2份樣品作為重復(fù)，保存至-80 ℃冰箱備用。普通白菜C-14-007的2份樣品編號為T01、T02，黃心烏1408的2份樣品編號為T03、T04、黑心烏1422的2份樣品編號為T05、T06?；贗llumina HiSeq2500測序技術(shù)平臺，利用雙末端測序（Paired-End）的方法，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行雙末端測序，獲得轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取與檢測 采用天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒提取安徽烏菜自交系1408、1422和普通白菜C-14-007第15片葉的總RNA，分別采用Nanodrop分光光度計、Qubit 2.0熒光計、Aglient 2100生物分析儀檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性等，以保證使用合格的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 RNA文庫構(gòu)建、RNA-Seq及文庫質(zhì)控

RNA樣品檢測合格后，利用Illumina’s TruSeq RNA Sample Preparation Kit（Illumina Inc，San Diego，CA，USA）構(gòu)建mRNA-Seq文庫。mRNA的純化、片段打斷、cDNA合成、加接頭、PCR擴(kuò)增以及RNA-Seq均在北京百邁客生物科技有限公司完成。文庫構(gòu)建完成后，分別使用Qubit 2.0熒光計和Agilent 2100生物分析儀對文庫的濃度和插入片段大小（insert size）進(jìn)行檢測，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。

1.2.3 數(shù)據(jù)組裝 去掉低質(zhì)量的reads，利用Trinity軟 件（http：//trinityrnaseq.sourceforge.net/） 對 clean reads進(jìn)行組裝。首先將測序reads打斷為較短的片段（K-mer），然后將這些小片段延伸成較長的片段（contig），并利用這些片段之間的重疊，得到片段集合（component），最后利用de Bruijn圖的方法和測序reads信息，在各個片段集合中分別識別轉(zhuǎn)錄本序列。

1.2.4 差異表達(dá)基因的篩選 FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）是每百萬reads中來自比對到某一基因每千堿基長度的reads數(shù)目，是轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析中常用的基因表達(dá)水平估算方法。FPKM能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達(dá)的影響，計算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異。在篩選過程中，將FDR（false discovery rate）＜0.01且差異倍數(shù)FC（fold change）≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，其中FC表示兩樣品（組）間表達(dá)量的比值。普通白菜與黃心烏差異基因以G1表示，普通白菜與黑心烏的差異基因以G0表示。

1.2.5 差異表達(dá)基因功能注釋 使用BLAST軟件將差異表達(dá)基因序列與nr（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GO（http：//www.geneontology.org/）、COG（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）、KEGG（http：//www.genome.jp/kegg）數(shù)據(jù)庫比對，獲得注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)組裝

利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對普通白菜和安徽烏菜（黃心烏、黑心烏）進(jìn)行分析，通過轉(zhuǎn)錄組測序共獲得27.75 Gb clean data，各樣品測序數(shù)據(jù)量均達(dá)到4.00 Gb，Q30堿基百分比在90.53%以上。由表1可知，通過組裝共得到127 988條轉(zhuǎn)錄本和46 950條unigene，平均長度分別為1 327.71 bp和856.26 bp，轉(zhuǎn)錄本與unigene的N50長度分別為1 857 bp和1 505 bp，而≥1 000 bp的unigene共13 076條（27.85%）。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)組裝結(jié)果

2.2 差異基因篩選

以FDR＜0.01且FC≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選到普通白菜與黃心烏的差異基因（G1）共3 191個，普通白菜與黑心烏的差異基因（G0）共2 180個，G1與G0共同的差異基因有1 296個。

2.3 差異表達(dá)基因功能注釋

將篩選到的1 296個共同差異表達(dá)基因與COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、nr等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共有1 156個差異表達(dá)基因被注釋，其中223個差異表達(dá)基因注釋到COG數(shù)據(jù)庫，864個差異表達(dá)基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫，200個差異表達(dá)基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫，445個差異表達(dá)基因注釋到KOG數(shù)據(jù)庫，716個差異表達(dá)基因注釋到Pfam數(shù)據(jù)庫，785個差異表達(dá)基因注釋到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫，1 150個差異表達(dá)基因注釋到nr數(shù)據(jù)庫。

注釋到COG數(shù)據(jù)庫中的差異表達(dá)基因有223個，占差異表達(dá)基因總數(shù)的17.21%，這些基因按功能進(jìn)行分類，共分為21類，其中一般功能預(yù)測類基因共72個（32.29%），其次是與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的差異基因有36個（16.14%），復(fù)制、重組及修復(fù)類功能基因共35個（15.70%），而核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝功能相關(guān)基因有3個（1.35%）（圖1）。

圖1 安徽烏菜與普通白菜差異表達(dá)基因COG數(shù)據(jù)庫功能注釋

注釋到GO數(shù)據(jù)庫中的差異表達(dá)基因有864個（66.67%），分為細(xì)胞組成、生物過程、分子功能3大類53個分支，其中細(xì)胞組成類基因共764個，生物過程類基因共707個，分子功能類基因共595個，細(xì)胞組成、生物過程、分子功能全包含的差異表達(dá)基因486個。在細(xì)胞組成類基因中，與細(xì)胞組分相關(guān)的基因和與細(xì)胞相關(guān)的基因均為597個；在分子功能類基因中，與結(jié)合相關(guān)的基因380個，其次是與催化活性相關(guān)的基因357個；在生物過程類基因中，與細(xì)胞過程相關(guān)的基因、與代謝過程相關(guān)的基因及與單個有機(jī)體過程相關(guān)的基因均為441個（圖 2）。

KEGG數(shù)據(jù)庫能夠系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及功能。將普通白菜與黃心烏的差異表達(dá)基因和普通白菜與黑心烏的差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果有200個差異表達(dá)基因被注釋到80條通路，這些通路分別參與遺傳信息過程、有機(jī)系統(tǒng)、環(huán)境信息過程、代謝和細(xì)胞過程。在這些差異表達(dá)基因中，參與植物病原菌互作通路的最多（ko04626，22個），其次是參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（ko04075，19個）和類苯基丙烷生物合成通路（ko00940，11個）（圖3）；而參與油菜素類固醇生物合成（ko00905）、單萜類生物合成（ko00902）等通路的差異表達(dá)基因只有1個。在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（ko04075）中，與生長素合成相關(guān)的基因有4個，與玉米素生物合成相關(guān)的基因有2個，與油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)的基因有2個。

圖2 安徽烏菜與普通白菜差異表達(dá)基因GO數(shù)據(jù)庫功能注釋

圖3 安徽烏菜與普通白菜差異表達(dá)基因KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋

3 結(jié)論與討論

葉片是植物光合作用的主要器官，葉片性狀能夠反映植物適應(yīng)環(huán)境變化所形成的生存對策，是指示植物生理生態(tài)特征及對環(huán)境變化適應(yīng)對策的有效指標(biāo)（宋璐璐 等，2011）。葉面上有皺泡是安徽烏菜區(qū)別于其他白菜亞種的一個典型特征，葉面皺泡的產(chǎn)生增加了葉面積，直接影響了比葉面積（葉面積與葉片干質(zhì)量的比值，SLA）大小，比葉面積是植物獲取資源的衡量指標(biāo)，在很大程度上可以解釋植物光合作物、呼吸作用、葉壽命和潛在生長速率的種間變異（Ackerly et al.，2002）。筆者認(rèn)為安徽烏菜是普通白菜從南到北過渡過程中為了適應(yīng)環(huán)境變化而逐漸進(jìn)化而成，因此安徽烏菜與普通白菜相比具有更強(qiáng)的抗寒性（Tian et al.，2018）。差異表達(dá)基因存在于植物不同生長發(fā)育期、不同組織、不同處理和不同品種間，可通過研究差異表達(dá)基因探討生理變化的機(jī)制（Logacheva et al.，2011；Wang et al.，2013；Wu et al.，2014；Zhang et al.，2016）。本試驗對安徽烏菜和普通白菜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，獲得安徽烏菜和普通白菜差異表達(dá)基因，為發(fā)掘安徽烏菜葉部性狀變異的分子機(jī)制和研究白菜類蔬菜進(jìn)化提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

葉片發(fā)育受植物體內(nèi)嚴(yán)格的遺傳機(jī)制和體外環(huán)境因子的調(diào)控，植物激素尤其是生長素在協(xié)調(diào)體內(nèi)、外調(diào)節(jié)機(jī)制中起著不可或缺的作用，越來越多的研究表明生長素的穩(wěn)態(tài)調(diào)控、劑型運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與葉片發(fā)育和形態(tài)建成具有緊密聯(lián)系，暗示生長素在葉片生長發(fā)育過程中具有關(guān)鍵的調(diào)控功能（李林川和瞿禮嘉，2006）。Wang等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，白菜在基因組發(fā)生加倍之后，與器官形態(tài)變異有關(guān)的生長素相關(guān)基因發(fā)生了顯著的擴(kuò)增，白菜基因組復(fù)制導(dǎo)致了許多與形態(tài)變異有關(guān)的基因存在更多拷貝，這可能是白菜類蔬菜具有豐富的根、莖、葉形態(tài)變異的根本原因。本試驗通過對黑心烏、黃心烏與普通白菜進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，共獲得1 296個差異表達(dá)基因，200個差異表達(dá)基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫，19個基因參與了植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中與生長素合成相關(guān)的基因有4個。1種激素往往參與調(diào)節(jié)發(fā)育過程的多個方面，多種激素也可以同時參與調(diào)控某一特定發(fā)育過程（Gray，2004）。如玉米素主要分布于進(jìn)行細(xì)胞分裂的部位，對細(xì)胞的伸長有阻礙作用，控制頂端優(yōu)勢，促進(jìn)細(xì)胞的橫向擴(kuò)張（杜旭升和蒲曉亞，2014）；油菜素內(nèi)酯調(diào)控細(xì)胞的伸長和細(xì)胞分裂，同時還可促進(jìn)光合作用和提高抗逆性。本試驗從參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的19個基因中發(fā)現(xiàn)了2個與玉米素合成相關(guān)的基因，2個與油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)的基因。這些結(jié)論將為下一步的基因發(fā)掘提供支持。今后將繼續(xù)研究與植物激素、次生代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，為探討安徽烏菜葉部形態(tài)變異分子機(jī)制提供一定的數(shù)據(jù)支持。