microRNA363在缺血性腦損傷中的表達(dá) 及頭電針調(diào)控作用研究*

張立峰,孫先越,張曉丹,程玉宏,李仕奎,王麗麗,李凌雁

(1.大慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，黑龍江 大慶 163312; 2.大慶油田總醫(yī)院，黑龍江 大慶 163312)

腦血管病是危害人類健康的常見病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點，目前是世界第三大死因[1]。有研究表明[2]，在急性缺血性腦損傷中半胱氨酸天冬酶(Caspase)扮演著重要角色，半胱氨酸天冬酶是凋亡程序啟動和執(zhí)行過程中的一類蛋白酶家族，參與神經(jīng)凋亡的早期啟動，Caspase-3是其中最具代表性的蛋白，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，也是多種凋亡途徑共同的下游效應(yīng)部分。近年發(fā)現(xiàn)[3]Caspase-3表達(dá)與一部分微小RNA(microRNA，miRNA) 密切相關(guān)。新近研究表明[4]，上調(diào)microRNA363在人腦膠質(zhì)瘤中可增加細(xì)胞存活和增殖，說明microRNA363可能具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。但對缺血性腦損傷的作用及與Caspase-3的相關(guān)性目前尚無報道。猜測Caspase-3可能受microRNA363的調(diào)控，進(jìn)而抑制神經(jīng)元的凋亡。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，擬從microRNA水平與神經(jīng)細(xì)胞凋亡間的關(guān)系及頭電針對其影響作用進(jìn)行研究，一方面探索microRNA363在急性腦缺血損傷中是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，能否作為早期診斷缺血性腦血管病的生物標(biāo)記物，另一方面探討頭電針能否通過調(diào)控microRNA363表達(dá)，進(jìn)而影響Caspase-3水平，以達(dá)到抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的目的。

1 材料與方法

1.1 腦缺血模型建立

選用清潔級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠100只,體質(zhì)量(250±30)g，隨機(jī)選取其中80只，采用10%水合氯醛0.4～0.5 mL/kg體重腹腔注射，麻醉大鼠。用改良的Longa線栓法[5]建立永久性大腦中動脈阻塞腦缺血模型，均阻斷左側(cè)大腦中動脈24 h。另20只不阻斷動脈，作為假手術(shù)組。

1.2 實驗分組

參照Longa[5]5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。得分在1～4分的為手術(shù)成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為4組：①模型組：造模成功后，不進(jìn)行頭針治療，正常飲食；②非穴區(qū)組：在頭針穴區(qū)向后平移0.5 cm，與穴區(qū)平行的部位進(jìn)行針刺；③頭針組：頭針治療；④頭電針組：頭電針治療。假手術(shù)組：不阻斷左側(cè)大腦中動脈，肢體功能正常，正常飲食，不進(jìn)行針刺治療。

1.3 頭針及頭電針治療

造模48 h后給予頭電針方法，按照“大鼠穴位圖譜”所示，使用華佗牌針灸針(0.25 mm×25 mm)在大鼠右側(cè)取頂顳前斜線(前神聰→懸厘)進(jìn)針，上下各一針，平刺，深度為15 mm。針后連接電針治療儀，選取100 Hz/2 Hz疏密波，強(qiáng)度為1 mA，刺激時間為30 min，每日1次。

1.4 治療時間

非穴區(qū)組、頭針組及頭電針組分別治療7天。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 局灶性缺血大鼠神經(jīng)功能評定 參照Longa[5]5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

1.5.2 腦梗死體積 各組動物在腦缺血后處死，斷頭取腦，-20℃冷凍10 min后，切成厚度為2 mm腦片，在37℃的2%TTC溶液中染色30 min。染色之后浸入4%中性多聚甲醛溶液中保存，拍照、用圖象分析系統(tǒng)掃描缺血面積，再換算成體積，計算相應(yīng)腦組織總面積，據(jù)此計算各組動物腦組織的梗死率。

1.5.3 Caspase-3蛋白表達(dá) Western blot技術(shù)檢測。取相應(yīng)處腦組織，分別做HE染色，檢測Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

1.5.4 microRNA363 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測。取腦皮質(zhì)區(qū)組織標(biāo)本。使用miRNeasy Mini試劑盒提取總RNA。TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。將獲取的DNA稀10倍后進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)。采用2-△△CT法統(tǒng)計microRNA363表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評分比較

大鼠神經(jīng)功能Longa評分顯示，非穴區(qū)組、頭針組及頭電針組干預(yù)后較模型組均有顯著變化(P<0.05)，說明頭針對急性缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能具有較好效果；組間比較，頭針組與非穴區(qū)組干預(yù)后沒有顯著性差別(P>0.05)，頭電針組Longa評分明顯降低(2.45±0.69)，與頭針組及非穴區(qū)組比較均具有顯著性差異(P<0.05。見表1。

2.2 各組腦梗死體積比較

非穴區(qū)組、頭針組及頭電針組的腦梗死體積干預(yù)后均較模型組有明顯變化(P<0.05)，但頭針組(28.97±5.11)與非穴區(qū)組(29.16±4.65)比較，無明顯差異(P>0.05)；干預(yù)后，頭電針組腦梗死體積明顯減小(21.66±4.59)，較非穴區(qū)組和頭針組均有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

2.3 各組Caspase-3蛋白表達(dá)比較

假手術(shù)組有少量的Caspase-3蛋白表達(dá)，與假手術(shù)比較模型組蛋白水平增加(1.819±0.033)，明顯上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)(P<0.05)，說明腦損傷后Caspase-3蛋白表達(dá)顯著提高；非穴區(qū)組、頭針組及頭電針組與模型組分別進(jìn)行比較，干預(yù)后Caspase-3均有明顯下降(P<0.05)，說明頭針對急性缺血性腦損傷均具有明顯抗細(xì)胞凋亡作用；干預(yù)后，頭電針組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(1.310±0.040)，與非穴區(qū)組和頭針組比較均具有顯著性差異(P<0.05)，但非穴區(qū)組與頭針組之間比較，無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表1 各組Longa評分與腦梗死體積比較

注：與模型組比較,★P<0.05；與非穴區(qū)組比較,■P>0.05,△P<0.05；與頭針組比較,○P<0.05

表2 各組Caspase-3與microRNA363表達(dá)水平比較

注：與模型組比較,★P<0.05；與非穴區(qū)組比較,■P>0.05,△P<0.05；與頭針組比較,○P<0.05

2.4 各組microRNA363表達(dá)比較

模型組有少量的microRNA363表達(dá)(2.51±0.59)，與假手術(shù)組比較明顯下降(3.34±0.33)，說明腦損傷后microRNA363表達(dá)顯著下調(diào)；非穴區(qū)組、頭針組及頭電針組與模型組分別進(jìn)行比較，干預(yù)后均有明顯增加(P<0.05)，說明頭針對急性缺血性腦損傷均可顯著提高microRNA363表達(dá)；干預(yù)后，頭電針組microRNA363表達(dá)明顯上調(diào)(9.98±0.87)，與非穴區(qū)組和頭針組比較均具有顯著性差異(P<0.05)，但非穴區(qū)組與頭針組之間比較，無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.5 microRNA363表達(dá)與Caspase-3相關(guān)性分析

實驗結(jié)果顯示，急性腦缺血大鼠microRNA363明顯降低，Caspase-3表達(dá)明顯提高，行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.930，P<0.01)，說明在急性腦損傷中microRNA363呈低表達(dá)水平，過表達(dá)可能通過調(diào)控Caspase-3抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。見圖1。

圖1 microRNA363表達(dá)與Caspase-3相關(guān)性

3 討論

早期研究表明[6]，少數(shù)非編碼RNA ( non-coding RNA，ncRNA)可能作為遺傳信息傳遞的中間產(chǎn)物來協(xié)助蛋白質(zhì)的翻譯和RNA轉(zhuǎn)錄，但大部分ncRNA是沒有功能的，因此它并沒有引起足夠重視。然而近年研究顯示[7]，這類基因組的“暗物質(zhì)”不但在細(xì)胞分化、增殖和衰老過程中發(fā)揮重要作用，而且還可能參與了神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等疾病的病理進(jìn)程。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子非編碼RNA，大約由20～22個堿基組成。有研究表明[8]，miRNAs通過調(diào)控其靶mRNA 翻譯過程發(fā)揮基因表達(dá)的調(diào)控作用，從而廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等多種生物過程，目前在腦損傷機(jī)制研究中，miRNA是分子機(jī)制研究的熱點之一。新近研究表明[4]，上調(diào)microRNA363在人腦膠質(zhì)瘤中可增加細(xì)胞存活率和增殖率。

為探究microRNA363在缺血性腦損傷中表達(dá)及對Caspase-3影響，本實驗在缺血腦組織中進(jìn)行熒光定量PCR實驗，發(fā)現(xiàn)有明顯下降，同時發(fā)現(xiàn)Caspase-3水平有明顯上升，進(jìn)而進(jìn)行相關(guān)分析顯示，microRNA363與Caspase-3表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，說明在急性腦損傷中， microRNA363具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)理可能是通過調(diào)控Caspase-3從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。microRNA363可能作為早期診斷缺血性腦血管病的生物標(biāo)記物。

實驗第二部分是比較不同頭針方法治療的差異性。結(jié)果顯示經(jīng)頭針治療后，非穴區(qū)組、頭針組及頭電針組在Longa評分、腦梗死體積、Caspase-3表達(dá)及microRNA363均明顯優(yōu)于模型組，證實了頭針對急性缺血性腦損傷治療的有效性[9]，但非穴區(qū)組與頭針組比較沒有明顯差別，可能與以下因素有關(guān)：①頭針組選用穴區(qū)為右側(cè)取頂顳前斜線(前神聰→懸厘)進(jìn)針，此區(qū)域為大腦皮層中央前回在頭皮表面上的投影，非穴區(qū)組選取的穴區(qū)為頂顳前斜線向后平移0.5 cm處，兩者距離較近，腦損傷時，周圍神經(jīng)組織進(jìn)行代償，故在神經(jīng)功能恢復(fù)等方面，兩者無顯著性差異；②可能與針刺治療時間有關(guān)，治療時間為7天，可能尚未顯示出差異性。然而，頭電針組在上述指標(biāo)中，均明顯優(yōu)于非穴區(qū)組和頭針組。筆者分析首先本研究選取頂顳前斜線穴區(qū)是大腦皮層中央前回在頭皮表面上的投影，直接刺激能增強(qiáng)減退的大腦神經(jīng)元的能量代謝，有效促進(jìn)大腦側(cè)支循環(huán)的建立，從而減少皮層神經(jīng)細(xì)胞的死亡；其次，有文獻(xiàn)顯示[10-11]2 Hz電刺激信號通過下丘腦弓狀核、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、延腦到達(dá)脊髓背角神經(jīng)元，抑制其對傷害信號的傳遞；100 Hz電頻率激活一條較短的傳導(dǎo)通路，經(jīng)臂旁核、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、延腦到達(dá)脊髓背角神經(jīng)元。大量實驗顯示100 Hz電針和2 Hz電針是兩種性質(zhì)不同的治療方法[12]。本實驗筆者選取100 Hz/2 Hz疏密波進(jìn)行電刺激，兩種波形共同作用，一方面起到不同的治療效果，另一方面還可有效緩解患者的疲勞程度，避免出現(xiàn)治療的耐受性。

4 結(jié)論

microRNA363在早期腦缺血中明顯下調(diào)，與Caspase-3表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，說明microRNA363具有神經(jīng)保護(hù)作用，可作為早期診斷缺血性腦血管病的生物標(biāo)記物。

100 Hz/2 Hz疏密波頭電針可通過調(diào)控microRNA363表達(dá)，進(jìn)而影響Caspase-3水平，以達(dá)到抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的目的。