膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠敏化穴區(qū)肥大細(xì)胞 超微結(jié)構(gòu)的電鏡研究*

秦萍萍，丁 寧，劉瀟瀟，王巧俠，胡嘉同，許藝元，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

腧穴是臟腑、經(jīng)絡(luò)氣血輸注出入于體表的特殊部位，是針灸治療的主要施術(shù)部位。對腧穴的形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能及其發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究一直是針灸學(xué)科研工作的研究熱點(diǎn)，備受人們關(guān)注。腧穴是個體化的、動態(tài)的、敏化態(tài)的體表反應(yīng)部位，其大小和功能強(qiáng)弱隨機(jī)體功能變化而動態(tài)變化，腧穴在生理狀態(tài)下以“沉寂”為主，而在病理狀態(tài)下或受到外界刺激時表現(xiàn)為“激活態(tài)”，其反應(yīng)疾病和治療疾病的功能都將大大增強(qiáng)，機(jī)體由生理到病理的轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)了腧穴敏化過程[1-3]。敏化態(tài)腧穴是與疾病過程相關(guān)的體表特定的敏感部位，對于疾病的診斷和治療均有十分重要的意義。目前相關(guān)研究主要集中于腧穴敏化的機(jī)制[4-5]、生物物理特性[6]和敏化腧穴的客觀成像[7-9]。

肥大細(xì)胞(Mast cell，MC)主要分布于真皮及皮下結(jié)締組織，大多分布在靠近血管的地方。MC在經(jīng)絡(luò)循行線上相對集中[10]，在穴區(qū)數(shù)量較非穴區(qū)為多[11]，針刺可引起穴區(qū)MC數(shù)量增多，MC脫顆粒釋放腔內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生針刺效應(yīng)[12],此外敏化穴區(qū)MC聚集，脫顆粒率升高[5，13]。由此可知，MC是穴區(qū)重要的組織形態(tài)學(xué)組成部分，是腧穴敏化及針刺效應(yīng)發(fā)揮的關(guān)鍵因素之一。既往對敏化穴區(qū)MC的形態(tài)學(xué)研究較少，尤其是對超微結(jié)構(gòu)的觀察相對不足，鑒于此，本研究以膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)大鼠為研究模型，采用透射電鏡技術(shù)，觀察鶴頂、委中穴在敏化過程中穴區(qū)局部MC的超微結(jié)構(gòu)改變，對胞內(nèi)致密顆粒占比進(jìn)行定量分析，以探討腧穴敏化的MC機(jī)制及敏化穴區(qū)MC超微結(jié)構(gòu)改變的意義，為臨床選穴治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選用清潔級SD雄性大鼠18只，隨機(jī)分為正常組、生理鹽水組和模型組，每組各6只，體質(zhì)量(155±5)g。實(shí)驗(yàn)動物由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0002。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動物室，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，溫度為(23±1)℃，12 h光照，濕度45%，自由進(jìn)食及飲水，排除飲食、環(huán)境等因素對實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生的影響。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與主要試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 全波長掃描酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，型號：Multiskan GO)；低溫高速離心機(jī)(美國Beckman 公司，型號：ALLEGRA X-15R)；超薄切片機(jī)(德國Leica公司，型號：ULTRACUT、UCT/UC6)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司，型號：TECNAI SPIRIT)。

1.2.2 主要試劑 烏拉坦(美國Sigma公司，貨號：U2500),戊二醛(美國Solarbio,貨號：p1126),0.1MPBS(美國Gibco公司，貨號：10010023),單碘乙酸鹽(美國Sigma公司，貨號：I4386),3%醋酸鈾、枸櫞酸鉛、1%鋨酸、50%、75%、90%、100%乙醇、環(huán)氧丙烷、Epon812包埋劑、IL-1β、CTX-Ⅱ試劑盒(北京歐北生物科技有限公司)。

1.3 模型制備

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，正常組相同飼養(yǎng)條件下不做任何處理。參考文獻(xiàn)[14]并改進(jìn)，模型組于實(shí)驗(yàn)第0天，將3 mg單碘乙酸鹽(MIA)溶于50 μL無菌生理鹽水溶液，通過髕下韌帶注射至雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，建立MIA誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性KOA動物模型。生理鹽水組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)注射50 μL無菌生理鹽水溶液作為假陽性對照。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 組織取材 造模后14天，20%烏拉坦5 mL/kg行腹腔注射法麻醉，采用內(nèi)眥取血法，收集全血后靜置30 min，4℃、3 000 r/min離心15 min，分離后取上清液，-80℃冰箱冷凍備用。參照全國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)研究會制定的“實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位圖譜”選取鶴頂穴(EX-LE2)、委中穴(BL40)兩個穴位，局部穴區(qū)剃毛、消毒后取皮膚及皮下結(jié)締組織，規(guī)格為1 mm3，置于1.5%戊二醛中4℃固定待檢。

1.4.2 檢測方法 應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清中IL-1β、CTX-Ⅱ水平，檢測過程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 透射電鏡觀察 將所取組織置于1.5%戊二醛中4℃固定2 h，0.1MPBS洗滌2次，1%鋨酸4℃后固定2 h，0.1MPBS洗滌2次，梯度乙醇脫水，無水乙醇∶環(huán)氧丙烷(1∶1)脫水10 min，環(huán)氧丙烷脫水10 min，浸透、Epon812包埋、聚合。超薄切片，3%醋酸鈾與枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組ELISA法檢測結(jié)果比較

ELISA法檢測各組大鼠血清IL-1β、CTX-Ⅱ水平，結(jié)果顯示模型組大鼠血清IL-1β、CTX-Ⅱ水平均高于正常組與生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；生理鹽水組與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組MC超微結(jié)構(gòu)觀察比較

透射電鏡下，各組大鼠結(jié)締組織MC呈圓形或橢圓形，胞膜表面可見長短不一的絨毛狀突起。核膜內(nèi)側(cè)有異染色質(zhì)分布，核仁未見。胞核因受顆粒擠壓而變形，呈不規(guī)則狀。3組大鼠委中穴及正常組和生理鹽水組鶴頂穴穴區(qū)MC胞膜完整，胞質(zhì)中充滿大小不等的顆粒，顆粒表面光滑，無明顯皺縮，電子密度較高，分布均勻，未見明顯脫顆粒特征；模型組鶴頂穴穴區(qū)MC內(nèi)顆粒密度較低，顆粒外可見單位膜包裹，根據(jù)其密度可分為高密度顆粒、中等密度顆粒和低密度顆粒，但在密度高低的分類上沒有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。MC周圍可見有顆粒脫出，形態(tài)結(jié)構(gòu)與胞漿內(nèi)顆粒無明顯區(qū)別。顆粒間膜或顆粒與細(xì)胞膜融合形成脫顆粒管道，內(nèi)容物腫脹變大，通過管道釋放至胞外，同時伴電子密度降低，呈分散的細(xì)小致密點(diǎn)，甚至為網(wǎng)狀或泡沫狀外觀。顆粒釋放后膜結(jié)構(gòu)重新閉合，出現(xiàn)邊緣空隙或空泡樣結(jié)構(gòu)，分別稱為部分脫顆粒和完全脫顆粒。見封三彩圖1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、CTX-Ⅱ的 水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05,**P<0.01；與生理鹽水組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 各組大鼠不同穴區(qū)MC內(nèi)致密顆粒占比比較

參考文獻(xiàn)[15-16]并改進(jìn)，透射電鏡下由2名獨(dú)立的研究員觀察各組大鼠不同穴區(qū)各20例MC，分析胞漿顆粒密度，計算較高密度顆粒占總顆粒的百分比。結(jié)果顯示模型組鶴頂穴穴區(qū)MC胞內(nèi)致密顆粒占比顯著下降，與正常組及生理鹽水組同穴比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明模型組鶴頂穴穴區(qū)MC脫顆粒；模型組委中穴穴區(qū)MC胞內(nèi)致密顆粒占比無明顯變化，與正常組及生理鹽水組同穴比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明模型組委中穴穴區(qū)MC未發(fā)生明顯脫顆粒。正常組與生理鹽水組同穴比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠相關(guān)穴區(qū)MC胞內(nèi)致密顆粒 占比比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與生理鹽水組比較，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

腧穴與經(jīng)絡(luò)、臟腑相關(guān)聯(lián)，是疾病的反應(yīng)點(diǎn)和治療的刺激點(diǎn)[17]。敏化態(tài)腧穴可反映疾病，其對于治療刺激的高敏感性反應(yīng)對疾病的治療具有更高效的作用，因此對腧穴敏化現(xiàn)象規(guī)律的把握，可更加全面準(zhǔn)確地用于指導(dǎo)臨床，提高療效。MC與腧穴敏化密切相關(guān)，鑒于此,本研究聚焦于穴區(qū)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)——MC，研究機(jī)體由生理到病理狀態(tài)下，特定穴區(qū)MC超微結(jié)構(gòu)改變，以期能更好的認(rèn)識和理解腧穴敏化的含義。

KOA是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，屬于中醫(yī)“痹癥”的范疇，為經(jīng)絡(luò)病的代表之一。研究表明針刺可有效緩解關(guān)節(jié)疼痛，改善運(yùn)動障礙，在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用[18-19]。針刺治療KOA時首選膝關(guān)節(jié)周圍腧穴，其中鶴頂穴和委中穴的使用頻次較高[20-21]。腧穴可反應(yīng)疾病和治療疾病,疾病的常見治療用穴往往是疾病在體表的重要反應(yīng)點(diǎn)，因此本研究選取鶴頂穴和委中穴為研究對象，以期能更好的觀察敏化腧穴MC超微結(jié)構(gòu)改變的特點(diǎn)。

IL-1β與KOA密切相關(guān)，可介導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解過程中多種酶的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞，CTX-Ⅱ?yàn)檐浌亲冃詴r的重要產(chǎn)物。研究表明：IL-1、CTX-Ⅱ可輔助早期KOA的診斷，且其在血清中的含量可反映疾病的程度；不同嚴(yán)重程度KOA患者血清中IL-1β、CTX-Ⅱ含量有明顯差異[22-25],因此本項(xiàng)研究選取ELISA法檢測血清中這兩種物質(zhì)的水平，以此評價KOA大鼠模型是否制備成功。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-1β、CTX-Ⅱ水平均顯著高于正常組與生理鹽水組，表明KOA模型制備成功；生理鹽水組與正常組血清IL-1β、CTX-Ⅱ水平無明顯差異，可作為假陽性對照，以排除因注射對大鼠產(chǎn)生的影響。

透射電鏡顯示，模型組鶴頂穴穴區(qū)MC脫顆粒，致密顆粒占比顯著下降，從微觀水平確認(rèn)了腧穴的敏化特性，即機(jī)體由生理轉(zhuǎn)變?yōu)椴±頎顟B(tài)時腧穴實(shí)現(xiàn)了從“靜息態(tài)”到“激活態(tài)”的轉(zhuǎn)變；同組委中穴MC超微結(jié)構(gòu)未見明顯改變，表明特定疾病狀態(tài)下的腧穴敏化具有腧穴特異性。本研究中鶴頂穴和委中穴敏化的差異與目前針灸治療KOA的穴位選擇相一致(鶴頂穴使用頻次高于委中穴)[26-27]。敏化態(tài)腧穴可更好的反應(yīng)和治療疾病，因此對疾病敏感反應(yīng)較高的腧穴在臨床實(shí)踐中使用較多，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往研究均表明鶴頂穴對KOA的特異性相對較高。腧穴敏化與疾病相關(guān)并具有腧穴特異性，提示敏化與否可能是臨床選穴的重要依據(jù)，敏化態(tài)腧穴可能對疾病有更好的治療效果，值得進(jìn)一步深入研究。

本研究通過觀察KOA大鼠病變局部穴區(qū)MC超微結(jié)構(gòu)的改變，從微觀水平及客觀形態(tài)學(xué)上證明MC參與腧穴敏化，具體表現(xiàn)為特定穴區(qū)MC脫顆粒，這可能是腧穴敏化在細(xì)胞層面的重要機(jī)制之一。研究表明[28-29]成熟MC顆粒在形態(tài)上的區(qū)別與組成相關(guān)，不同程度的脫顆?？梢苑从愁w粒的快速或逐漸釋放以及同一過程的不同階段，也可以表示不同介質(zhì)定向分選和釋放的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示大鼠皮膚MC顆粒未見特殊超微結(jié)構(gòu)，脫顆粒分泌不同密度顆粒，提示敏化穴區(qū)MC釋放物質(zhì)類型可能與電子密度的高低有關(guān)，但具體關(guān)系尚不清楚。腧穴敏化過程中MC脫顆粒釋放5-HT和HA[5]，5-HT和HA可進(jìn)一步激活MC，促進(jìn)其連續(xù)脫顆粒[30-31],此外5-HT和HA具有調(diào)節(jié)血管、改善微循環(huán)、引發(fā)炎癥反應(yīng)和參與神經(jīng)系統(tǒng)功能活動等作用[32-34]，進(jìn)而在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)之間產(chǎn)生交叉作用，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究結(jié)果提示MC可能在腧穴敏化中扮演始動因素，腧穴敏化可能涉及包括微血管[35-36]、細(xì)胞和分子在內(nèi)的多個層次水平，值得進(jìn)一步深入研究。