低溫條件下小麥葉綠體基因啟動(dòng)子甲基化的變化

楊 苑，肖 磊，汪宇迪 ，謝利萍，黃媛媛，郭藹光,2，徐 虹,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

DNA甲基化普遍存在于植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中表觀遺傳調(diào)控的重要途徑。目前對(duì)植物DNA甲基化的研究主要集中于核基因組DNA的甲基化，包括胞嘧啶甲基化(5mC)和腺嘌呤甲基化(6mA)。植物的核基因組DNA胞嘧啶甲基化水平和狀態(tài)，會(huì)在鹽堿、重金屬、干旱、低溫、病原物侵染等外界脅迫條件下發(fā)生變化，調(diào)控基因的表達(dá)與植物的脅迫應(yīng)答[1-5]。高等植物中有關(guān)DNA腺嘌呤甲基化的研究較少，且未見其在各種脅迫下的甲基化水平測(cè)定。研究表明，衣藻的6mA是基因轉(zhuǎn)錄活躍與表達(dá)的標(biāo)志，與 5mC的位置及相關(guān)功能均有很大不同，6mA 促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)，而 5mC對(duì)基因表達(dá)起抑制作用[6-7]。段洪超等[8]通過全轉(zhuǎn)錄組6mA測(cè)序及基因敲除試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)擬南芥mRNA上廣泛存在6mA，具有組織特異性，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

胞嘧啶DNA的甲基化程度會(huì)受到低溫脅迫的影響，但在不同類型的植物中結(jié)果不盡相同。對(duì)擬南芥[9]、玉米[10]、牡丹[11]、西瓜[12]等植物的研究表明，低溫引起核基因組甲基化程度降低，使低溫響應(yīng)基因和抗脅迫相關(guān)基因高表達(dá)。而對(duì)水稻的研究結(jié)果顯示，低溫下，耐寒品種LTH的花序的甲基化水平下調(diào)，根部甲基化水平上調(diào)；低溫敏感品種IR64的花序的甲基化水平也是下調(diào)，而葉片在經(jīng)受低溫脅迫后甲基化水平顯著提高，表明甲基化具有組織特異性[13]。對(duì)茶樹的研究表明，低溫下DNA 甲基化水平總體呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，且甲基轉(zhuǎn)移酶CsDRM2基因高表達(dá)[14]。

葉綠體(包括質(zhì)體)基因組DNA也可以被甲基化，目前對(duì)葉綠體中的DNA甲基化研究主要是5mC。研究表明，萊茵衣藻葉綠體基因甲基化可以調(diào)控衣藻雌雄配子的分化和合子的發(fā)育[15-19]，并有定位于葉綠體的甲基轉(zhuǎn)移酶參與調(diào)控[20-21]。對(duì)高等植物葉綠體基因組的甲基化研究主要探討了葉綠體基因組的甲基化是否會(huì)調(diào)控葉綠體基因的表達(dá)，是否與發(fā)育相關(guān)。對(duì)大麥的研究表明，在葉片發(fā)育過程中并沒有葉綠體基因的甲基化參與調(diào)控[22]。Marano和Carrillo[23]對(duì)西紅柿的葉綠體基因進(jìn)行甲基化分析，結(jié)果顯示，葉綠體基因甲基化并不參與調(diào)控非光合相關(guān)的葉綠體基因的表達(dá)。Ahlert等[24]在煙草上通過轉(zhuǎn)入甲基化酶基因后研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄對(duì)葉綠體基因甲基化并不敏感，DNA甲基化并不參與調(diào)控葉綠體基因的表達(dá)。

與上述結(jié)論略有不同，Ngernprasirtsiri 等[25-26]對(duì)不同發(fā)育階段歐亞槭樹細(xì)胞系及玉米葉肉細(xì)胞的研究表明，Rubisco大亞基編碼基因rbcL的表達(dá)與甲基化水平變化相關(guān)，非甲基化時(shí)會(huì)正常轉(zhuǎn)錄，甲基化狀態(tài)下會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄；但rrn16S基因的甲基化與轉(zhuǎn)錄活性之間并無關(guān)聯(lián)；且在綠色的葉片和綠色的細(xì)胞系中，葉綠體基因的甲基化水平很低，但在黃化的葉片和白色異樣細(xì)胞系中，質(zhì)體基因的甲基化水平較高。總體上，目前對(duì)高等植物葉綠體基因組甲基化的研究并不深入，對(duì)葉綠體基因組甲基化是否參與調(diào)控葉綠體基因的表達(dá)、以及調(diào)控的機(jī)制都并未得出明確的結(jié)果。迄今對(duì)小麥葉綠體基因甲基化的研究較少，有關(guān)低溫條件下葉綠體基因組甲基化的研究尚未有過報(bào)道。

葉綠體DNA甲基化測(cè)定方法有高效液相色譜(HPLC) 、特異性酶切結(jié)合Southern雜交、亞硫酸鹽直接測(cè)序法(BSP-seq) 等，研究甲基化與基因表達(dá)關(guān)系的策略有體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)甲基化酶基因以及實(shí)時(shí)定量PCR等[24-26]。亞硫酸鹽法可以精確測(cè)出C&G甲基化位點(diǎn)情況[27-28]，用亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C) 脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U) ，5′甲基胞嘧啶(5′mC) 保持不變；再經(jīng)PCR擴(kuò)增，U轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶(T) ，而5′mC重新恢復(fù)為C，由此可將基因中的C與5′mC區(qū)別開。根據(jù)現(xiàn)有的各種甲基化測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)合水稻[29]、擬南芥[30]、菜豆[31]等植物的基因組甲基化的測(cè)定方法，本研究擬用優(yōu)化過的BSP-seq法對(duì)小麥葉綠體基因啟動(dòng)子的甲基化水平進(jìn)行測(cè)定。

小麥返白系是對(duì)低溫敏感的白化小麥，是一個(gè)很好的遺傳學(xué)研究材料 。已有研究表明，返白系與對(duì)照矮變1號(hào)的葉綠體基因表達(dá)在常溫和低溫下均有差異，而且在常溫與低溫下的差異模式并不相同[32-33]。本研究選擇返白系與矮變1號(hào)在常溫和低溫下表達(dá)都有差異的4個(gè)葉綠體編碼基因：petN(編碼細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體亞基Ⅷ)、trnC(編碼半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)、petD(編碼細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體亞基Ⅳ)和rrn16S(編碼16S核糖體RNA)，分析低溫條件下所選小麥葉綠體基因啟動(dòng)子甲基化的變化規(guī)律， 并對(duì)預(yù)測(cè)定位于葉綠體的DNA甲基化酶的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以建立小麥葉綠體基因啟動(dòng)子甲基化測(cè)定體系，明確甲基化水平與葉綠體基因表達(dá)的關(guān)系，為揭示葉綠體基因甲基化調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以(TriticumaestivumL.) 小麥矮變1號(hào)和返白系為材料(均為李丕皋研究員惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存) ，在光照培養(yǎng)箱中正常水肥培養(yǎng)至兩葉一心期，移至4 ℃低溫光照培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別取低溫0 d、5 d、80 d(已白化) 處理的整株小麥在液氮中速凍，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

用CTAB法提取小麥基因組DNA，參考Saghai-Maroof等[34]的方法，-20 ℃保存。

1.2.2 用亞硫酸鹽處理基因組DNA

取約2 μg基因組DNA于1.5 mL的EP管中，用滅菌ddH2O稀釋至50 μL，加5.5 μL新鮮配制的3 mol·L-1NaOH，42 ℃水浴30 min；加30 μL 10 mmol·L-1對(duì)苯二酚(氫醌) ，溶液變成淡黃色；加入520 μL 的3.6 mol·L-1亞硫酸氫鈉溶液。EP管外裹以鋁箔紙，避光條件下輕柔顛倒混勻；加入200 μL石蠟油(防止水分蒸發(fā)，限制氧化) ，52 ℃避光水浴16 h。

將移液器槍頭伸入石蠟油層下，吸取混合液至一潔凈的1.5 mLEP管中，用DNA純化試劑盒(Takara) 進(jìn)行純化回收，加5.5 μL新鮮配制的3 mol ·L-1NaOH，室溫放置15 min后加33 μL的10 mol·L-1的乙酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH 至7.0；加入4 μL 10 mg·mL-1的糖原以提高回收率，之后加270 μL無水乙醇，于-20 ℃下靜置30 min。于4 ℃下10 000 r·min-1離心30 min，倒去上清液，收集沉淀，加500 μL 70%乙醇洗滌2次，室溫干燥5 min，加入30 μL滅菌ddH2O溶解沉淀并在-20 ℃保存。

1.2.3 甲基化葉綠體基因啟動(dòng)子序列擴(kuò)增引物選擇

選取低溫條件下返白系和矮變1號(hào)中表達(dá)差異明顯的葉綠體基因petN、trnC、petD和rrn16S，依據(jù)對(duì)返白系與矮變1號(hào)小麥葉綠體基因組測(cè)序結(jié)果，以葉綠體基因啟動(dòng)子上游1kb片段為模板，應(yīng)用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物(具體如表1)，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2.4 克隆啟動(dòng)子序列

以亞硫酸鹽修飾后的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：基因組DNA 150 ng，ExTaq酶 0.25 μL，Primer F/R(10 μmol) 各1 μL，dNTPs(25 μmol) 2 μL，10× ExTaqPCR bμffer 5 μL，ddH2O加至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min， 35 Cycles；72 ℃ 7 min。

PCR產(chǎn)物用0.8%凝膠電泳，切膠回收后按操作指南連接至pMD19T(Takara) 載體，熱激法轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。分別挑取10～15個(gè)白色菌落于3 mL LB液體培養(yǎng)基(Amp+) 中37 ℃、180 r·min-1搖菌過夜，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行下一步甲基化位點(diǎn)的分析。

表1 葉綠體基因啟動(dòng)子序列擴(kuò)增引物Table 1 Primers for the amplification of chloroplast genes promoter region

1.2.5 qPCR檢測(cè)4個(gè)葉綠體基因的表達(dá)

依據(jù)葉綠體基因組測(cè)序結(jié)果，通過Primer Premier 5設(shè)計(jì)4個(gè)葉綠體基因petN、trnC、petD、rrn16S的qPCR引物(表2) ，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表2 4個(gè)葉綠體基因qPCR引物序列Table 2 Primers of four chloroplast genes used for qPCR

用TRNzol法提取小麥心葉組織RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司) 說明書流程將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR。qPCR反應(yīng)體系10 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，5.0 μL；Forward Primer，0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 cycles；95 ℃10 s，65 ℃～95 ℃每5 s增加0.5 ℃，分析溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后采用2-△△ct法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析，以β-actin基因作為內(nèi)參基因，計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量，作圖并分析。

1.2.6 甲基化測(cè)序結(jié)果分析

通過QUMA在線網(wǎng)站(http://quma.cdb.riken.jp/) 將4個(gè)葉綠體基因啟動(dòng)子10個(gè)單克隆的測(cè)序結(jié)果與基因啟動(dòng)子序列(本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果) 進(jìn)行比對(duì)，得到啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化具體位置及甲基化概率信息。計(jì)算公式如下：

單個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化率 =(該位點(diǎn)甲基化樣品數(shù)/可預(yù)測(cè)到的該位點(diǎn)的總樣品數(shù)) × 100%

基因總甲基化率=基因所有CpG位點(diǎn)甲基化率的均值

應(yīng)用PlantCARE在線網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/) 分析基因啟動(dòng)子順式元件，主要關(guān)注低溫響應(yīng)元件。

1.2.7 預(yù)測(cè)定位于葉綠體的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)分析

通過Genbank，Ensemble plant數(shù)據(jù)庫(kù)查找DNA甲基轉(zhuǎn)移酶序列信息，利用WoLF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html) 和ChloroP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) 在線網(wǎng)站對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行細(xì)胞亞定位預(yù)測(cè)分析，初步預(yù)測(cè)出TaMET1、TaCMT和TaDRM家族的3個(gè)基因(Genbank號(hào)分別為BT009495、AK332918、AK447940，表3)可能定位于葉綠體。通過qPCR對(duì)檢測(cè)這3個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)情況，方法同1.2.5，應(yīng)用PlantCARE在線網(wǎng)站分析3個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子順式作用元件。

2 結(jié) 果

2.1 葉綠體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化測(cè)定體系的建立

首先以petN基因啟動(dòng)子區(qū)段DNA的甲基化測(cè)定為例，簡(jiǎn)要說明本研究葉綠體基因啟動(dòng)子甲基化測(cè)定及數(shù)據(jù)分析的流程。

取室溫生長(zhǎng)的返白系與矮變1號(hào)幼苗葉片，提取總基因組DNA后用BSP處理，擴(kuò)增petN基因的啟動(dòng)子區(qū)序列，得到的啟動(dòng)子片段長(zhǎng)877 bp(表 1)。隨機(jī)挑取10個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果輸入QUMA在線軟件，通過比對(duì)測(cè)序樣品和原啟動(dòng)子基因組序列，分析甲基化的位點(diǎn)數(shù)及每個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，得到甲基化分析圖(圖1) 。

表3 甲基轉(zhuǎn)移酶qPCR引物序列Table 3 Primers of methyltransferase genes used for qPCR

A:矮變1號(hào)中甲基化點(diǎn)圖; B:返白系中甲基化點(diǎn)圖; ○:非甲基化; ●:甲基化 ; ×:未檢測(cè)到。A:Methylation point map in Aibian 1; B:Methylation point map in Albinism line; ○:Unmethylated site; ●:Methylated site ; ×:Not detected.

由圖1 可以看出，返白系與矮變1號(hào)的petN基因啟動(dòng)子片段中，都預(yù)測(cè)到20個(gè)可能的甲基化修飾位點(diǎn)以及各位點(diǎn)的甲基化信息。統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)的信息，計(jì)算各位點(diǎn)的甲基化率，并取各位點(diǎn)甲基化率的平均值得到總的甲基化率(表4)。

2.2 低溫條件下小麥葉綠體基因啟動(dòng)子的甲基化變化

對(duì)4個(gè)葉綠體基因trnC、petN、petD、rrn16S啟動(dòng)子區(qū)域分別進(jìn)行甲基化測(cè)定，結(jié)果見表5?？偟目磥?，在低溫處理后petN、trnC和rrn16S基因的甲基化水平呈上調(diào)趨勢(shì)，petD基因的甲基化率變化不明顯，兩個(gè)材料中各基因的變化模式略有不同。低溫處理后，petN和petD啟動(dòng)子甲基化率表現(xiàn)為返白系高于矮變1號(hào)；trnC的甲基化率則表現(xiàn)為矮變1號(hào)高于返白系；rrn16S基因甲基化水平在矮變1號(hào)中先降低后升高，在返白系中則是先升高后降低，所以短時(shí)間低溫處理后在返白系中的甲基化率高于矮變1號(hào)，而長(zhǎng)期低溫處理則是矮變1號(hào)高于返白系。

低溫條件下，兩個(gè)材料總的葉綠體基因組甲基化率均有所升高，在矮變1號(hào)中是持續(xù)增加，而在返白系中是先升高后降低。長(zhǎng)期低溫后，返白系中的葉綠體基因組甲基化率略低于矮變1號(hào)。

2.3 低溫下甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)

如圖2所示，在返白系中，三個(gè)基因的表達(dá)均隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；在矮變1號(hào)中，TaMET1基因與TaCMT基因的表達(dá)隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下調(diào)；低溫處理80 d時(shí)，返白系中TaMET1基因與TaCMT基因的相對(duì)表達(dá)量分別約是矮變1號(hào)的4倍和2.5倍(圖2a和圖2b) 。TaDRM家族的AK447940基因在兩個(gè)材料中的表達(dá)都呈逐漸上調(diào)趨勢(shì)，說明該基因可以對(duì)長(zhǎng)期低溫產(chǎn)生積極響應(yīng)(圖2c) 。

2.4 低溫條件下4個(gè)葉綠體基因相對(duì)表達(dá)量變化

由圖3可知，4個(gè)葉綠體基因相對(duì)表達(dá)量在返白系和矮變1號(hào)中存在差異。petN基因在兩個(gè)材料中均隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)呈持續(xù)下調(diào)趨勢(shì)；其余三個(gè)基因在短期低溫處理時(shí)相對(duì)表達(dá)量增加，長(zhǎng)期低溫處理的相對(duì)表達(dá)量則因基因和材料而異。在低溫處理前，petN、petD、rrn16S基因在返白系的相對(duì)表達(dá)量均高于矮變1號(hào)，而經(jīng)過80 d低溫處理后，這三個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量都是返白系低于矮變1號(hào)；trnC基因相對(duì)表達(dá)量的變化則相反。

表4 petN基因啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)的甲基化率Table 4 Methylation rate of CpG site of petN promoter %

表5 低溫處理后4個(gè)葉綠體基因啟動(dòng)子甲基化率Table 5 Methylation rate of four chloroplast gene promoters in cold %

用PlantCARE在線網(wǎng)站分析各基因啟動(dòng)子序列的順式作用元件，結(jié)果顯示，四個(gè)基因都有光響應(yīng)元件，并且trnC基因和petD基因啟動(dòng)子區(qū)都有低溫響應(yīng)元件(LTR，CCGAAA)。trnC基因啟動(dòng)子LTR元件位于已擴(kuò)增的啟動(dòng)子序列473 bp處(表1)，petD基因的LTR位于338 bp處(表1)，恰好分別位于一個(gè)預(yù)測(cè)的甲基化位點(diǎn)(表6)。

分析兩個(gè)LTR元件的甲基化率變化看出，長(zhǎng)期低溫下兩個(gè)LTR元件處的甲基化率都增加，trnC基因LTR的甲基化率在兩個(gè)材料中持續(xù)增加，petD基因LTR的甲基化率在兩個(gè)材料間變化不同，在矮變1號(hào)中是先升高后降低，在返白系中則是先降低后升高。

a:BT009495 ; b:AK332918; c:AK447940

a:petN基因的表達(dá)；b:trnC基因的表達(dá)；c:petD基因的表達(dá)；d:rrn16S基因的表達(dá)a:Expression of petN; b:Expression of trnC; c:Expression of petD; d:Expression of rrn16S

表6 trnC與petD基因LTR位點(diǎn)的甲基化水平Table 6 Methylation rate of LTR element in trnC and petD promoter region %

3 討 論

3.1 低溫對(duì)小麥葉綠體基因甲基化的調(diào)控

對(duì)擬南芥等植物的研究結(jié)果表明，低溫可以引起一些植物核基因組DNA甲基化水平降低，調(diào)控低溫響應(yīng)基因和抗脅迫相關(guān)基因高表達(dá)[6-9]，但對(duì)另一些植物的研究結(jié)果卻相反，低溫可以誘導(dǎo)DNA整體甲基化水平升高[13-14]。對(duì)玉米和歐亞槭樹細(xì)胞的研究表明，黃化葉片中的前質(zhì)體或異養(yǎng)細(xì)胞系的造粉體中葉綠體基因組的甲基化率是升高的[25-26]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，短期低溫脅迫(5 d)可以引起小麥總的葉綠體基因組甲基化率升高，長(zhǎng)期低溫(80 d)可以使矮變1號(hào)的甲基化率持續(xù)增加，但返白系中的葉綠體基因甲基化率反而下調(diào)。返白系中，經(jīng)過長(zhǎng)期低溫，葉片已經(jīng)白化，葉片中大多是類囊體結(jié)構(gòu)降解的質(zhì)體空泡[35]，成為完全退化的葉綠體，其甲基化率降低的原因有待進(jìn)一步探究。4個(gè)葉綠體基因中，3個(gè)葉綠體基因啟動(dòng)子的甲基化率是增加的，1個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化率變化不大，說明在葉綠體基因組中不同功能基因的甲基化率變化有差異，與Ngernprasirtsiri等[25-26]的研究結(jié)果一致。

我們對(duì)小麥中的DNA甲基化酶進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)可能定位于葉綠體中的三個(gè)DNA甲基化酶基因進(jìn)行了表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果說明兩個(gè)材料間存在差異。用PlantCARE在線網(wǎng)站對(duì)這3個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，TaMET1和TaCMT家族的BT009495 和AK332918基因啟動(dòng)子序列有ABA響應(yīng)元件(ABRE) 和低溫響應(yīng)元件(LTR)，TaDRM家族的AK447940基因有ABRE元件，由此認(rèn)為，低溫和ABA信號(hào)可以誘導(dǎo)3個(gè)基因的表達(dá)，與返白系中低溫下基因表達(dá)上調(diào)的研究結(jié)果較為相符。但矮變1號(hào)中，TaMET1和TaCMT基因在低溫處理后逐漸下調(diào)表達(dá)，揭示可能有其他因子共同參與調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。對(duì)三個(gè)基因編碼蛋白準(zhǔn)確的亞細(xì)胞定位、低溫條件下甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)上調(diào)與葉綠體總的基因甲基化率增加的相關(guān)性，以及兩個(gè)材料中的TaMET1與TaCMT基因表達(dá)模式不同，是否與返白系的白化相關(guān)，值得深入研究。

3.2 葉綠體基因啟動(dòng)子的甲基化修飾對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控

多年來，人們持續(xù)關(guān)注葉綠體基因組的甲基化是否具有功能、對(duì)葉綠體基因的表達(dá)起到調(diào)控作用，并影響到葉綠體、細(xì)胞或植物的發(fā)育。一些研究結(jié)果是肯定的[15-19,25-26], 而另有一些結(jié)果則認(rèn)為葉綠體基因組甲基化后并沒有對(duì)葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響[22-24]。

本研究分別測(cè)定了小麥中4個(gè)葉綠體基因啟動(dòng)子的甲基化率及基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)對(duì)數(shù)據(jù)的分析，我們認(rèn)為葉綠體基因組甲基化可以調(diào)控葉綠體基因的表達(dá)，有可能影響葉綠體的發(fā)育和功能，但葉綠體中只有部分基因是對(duì)甲基化敏感的，這與Ngernprasirtsiri等[25-26]的結(jié)論較為吻合，所不同的是我們篩選出的基因是petN，由于材料的特殊性，沒有檢測(cè)rbcL基因。petN基因編碼細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體亞基Ⅷ，該基因的表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化程度有一定的相關(guān)性：低溫處理后，基因啟動(dòng)子的甲基化率逐漸增加，基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸下調(diào)，兩個(gè)材料間相比較，啟動(dòng)子甲基化率較高時(shí)，基因的相對(duì)表達(dá)量較低。細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體是光合電子傳遞鏈中的一個(gè)重要電子傳遞體，該復(fù)合體亞基基因的變化可能會(huì)影響葉綠體的光合活性和其它功能。

trnC、petD、rrn16S這3個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化率與表達(dá)量并未表現(xiàn)出直接相關(guān)，但是對(duì)單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率分析比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，trnC和rrn16S基因啟動(dòng)子區(qū)存在特殊CpG位點(diǎn)，在兩個(gè)品種間甲基化率差異較大，且與基因總的甲基化率變化不符，這些特殊位點(diǎn)的甲基化是否對(duì)葉綠體基因表達(dá)起調(diào)控作用，需要后續(xù)試驗(yàn)的檢測(cè)分析。

葉綠體基因的表達(dá)受植物發(fā)育、各種外界因子、激素的綜合調(diào)控。本研究結(jié)果表明，trnC與petD兩個(gè)基因啟動(dòng)子有低溫響應(yīng)元件，petN與rrn16S基因在啟動(dòng)子區(qū)沒有低溫響應(yīng)元件。初步認(rèn)為，trnC、petD基因在低溫處理后表達(dá)量上調(diào)，可能是LTR對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控起到主要作用；petN基因啟動(dòng)子區(qū)沒有LTR，對(duì)甲基化較敏感，表達(dá)主要受到甲基化的調(diào)控；rrn16S基因在矮變1號(hào)中低溫處理前后表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定、甲基化水平變化不大，但長(zhǎng)期低溫后返白系中的表達(dá)量明顯低于矮變1號(hào)，推測(cè)其表達(dá)可能受到除低溫以外其他因子的調(diào)控。

本研究揭示了低溫條件下，小麥葉綠體基因組DNA總的甲基化率會(huì)升高，DNA甲基化參與了部分葉綠體基因的表達(dá)調(diào)控，但具體的調(diào)控機(jī)理及對(duì)葉綠體發(fā)育和功能的影響有待深入闡明。