大黃與抗生素體外協(xié)同抗哈維氏弧菌研究

郭偉良, 陳永貴, 鄧恒為,3, 鐘志鴻, 王 菲, 王世鋒, 孫 云, 陳雪芬, 周永燦

( 1.海南大學(xué)，南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228； 2.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228； 3.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275 )

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，養(yǎng)殖環(huán)境惡化也日趨嚴(yán)重，病害發(fā)生越來(lái)越頻繁，嚴(yán)重制約水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-3]。哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是海水環(huán)境中常見(jiàn)的條件致病菌，其致病性受宿主的生理狀態(tài)及水質(zhì)環(huán)境條件等多方面因素影響[4-5]。近年來(lái)哈維氏弧菌已成為海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要的病原菌之一，對(duì)海洋漁業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

抗生素由于具有起效快、效果好、促生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)動(dòng)物病害防控中得到大量的使用[6]，然而由于抗生素在使用過(guò)程中缺乏科學(xué)性指導(dǎo)，抗生素的使用受到極大的限制，為此人們不得不尋找水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害防控的綠色有效途徑[7-8]。目前，免疫制劑和中草藥防治最受推崇。免疫制劑效果較好，但其專一性較強(qiáng)，常常只是針對(duì)某種病原菌體，且會(huì)對(duì)變異后的病菌失效[9]。中草藥不僅毒副作用小、還具有增加食欲、提供營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力、提高抗病力和抗應(yīng)激力等多重功效，具有很好的開(kāi)發(fā)前景。然而中草藥一般起效慢，作用力溫和，對(duì)于突然爆發(fā)的流行性疾病的控制力弱[10-11]。近年來(lái)，中草藥聯(lián)合低劑量抗生素，共同應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害，起到很好的效果，被認(rèn)為是最有前途的水產(chǎn)動(dòng)物病害防控手段之一[12]。為了更好地將中草藥協(xié)同抗生素應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物病害防控中，對(duì)中草藥與抗生素之間相互作用的研究是非常必要且迫切的。

化學(xué)計(jì)量學(xué)是化學(xué)分析的常用方法，已被廣泛應(yīng)用于石油化工、農(nóng)業(yè)、林業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。其中響應(yīng)面法常用于工藝條件優(yōu)化[13-14]。響應(yīng)面法的最大優(yōu)點(diǎn)是，在合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)下，能以最少的試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)，獲取最大限度的試驗(yàn)信息，其采用多元二次回歸的方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，研究各因素及其交互作用對(duì)工藝過(guò)程考察指標(biāo)(響應(yīng)值)的影響，精確的表述各因素和考察指標(biāo)之間的關(guān)系。筆者在篩出體外抗哈維氏弧菌活性較好的中草藥基礎(chǔ)上，采用全組合方法初步篩選與中草藥具有協(xié)同抗菌作用的抗生素，然后采用中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法，分析中草藥與抗生素之間對(duì)哈維氏弧菌抑制活性的影響，精確的表述中草藥提取液含量、抗生素含量與抗哈維氏弧菌活性之間的關(guān)系，以確定其最佳配比，為中草藥協(xié)同抗生素在水產(chǎn)動(dòng)物病害防控中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

秦皮、黃連、大黃、五倍子、艾葉、金銀花、蒲公英(海南源安隆藥品超市)；強(qiáng)力霉素、金霉素和土霉素(寧波瑞源生物科技有限公司)，鏈霉素和新霉素(北京拜爾迪生物技術(shù)公司)，四環(huán)素(Sigma公司)；哈維氏弧菌為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存。

液體培養(yǎng)基：酵母粉1 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化鈉30 g/L、牛肉膏3 g/L；用1 mol/L的氫氧化鈉和鹽酸將pH調(diào)至7.5。半固體培養(yǎng)基(上層培養(yǎng)基)：液體培養(yǎng)基中加入1%的瓊脂粉制備而成。固體培養(yǎng)基(下層培養(yǎng)基)：液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉制備而成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中草藥水提液樣品的制備

7種中草藥于80 ℃烘箱中干燥2 h，用研缽研碎，過(guò)40目篩，制成粉末樣品。分別精密稱取5.0 g的7種中草藥粉末樣品，裝入250 mL具塞三角瓶中，加入50 mL水，浸潤(rùn)30 min，置于沸水浴中，提取2 h，8000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，制成生藥質(zhì)量濃度為100 mg/mL中草藥水提液樣品。

1.2.2 瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)藥物體外抗哈維氏弧菌活性[15]

將凍存管中哈維氏弧菌30 ℃水浴解凍、轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h，按1‰接種量接入新液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r/min培養(yǎng)16 h，按該條件再傳一代，4000 r/min離心收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水重懸菌體并稀釋使其600 nm處吸光度值為0.8(活菌密度約為2.82×108cfu/mL)。濕熱滅菌后的固體培養(yǎng)基趁熱倒入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿為15 mL，平放靜置冷凝。按2%(體積比)接種量將制備的菌懸液接入低于50 ℃而未冷凝的半固體培養(yǎng)基中，然后將半固體培養(yǎng)基倒入冷凝的裝有固體培養(yǎng)基的平皿中，每個(gè)平板10 mL，搖勻平放靜置冷凝。用內(nèi)徑為5 mm打孔器在雙層培養(yǎng)基上均勻打3個(gè)孔，在每個(gè)孔中加60 μL樣品，30 ℃培養(yǎng)16 h，采用游標(biāo)卡尺量抑菌圈直徑，每個(gè)樣品平行測(cè)3次，取平均抑菌圈直徑作為該樣品的抑菌圈直徑。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：篩出的生藥質(zhì)量濃度為100 mg/mL中草藥水提液作為母液，將母液和6種抗生素按設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度配制成6個(gè)等質(zhì)量濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度梯度范圍見(jiàn)表1。采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的抑菌圈直徑，以質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

篩選出具有體外抗哈維氏弧菌活性的中草藥水提液樣品。

1.2.3 全組合方法篩選與中草藥水提液協(xié)同抗哈維氏弧菌的抗生素

篩出的中草藥提取液，分別以一定質(zhì)量濃度與抗生素進(jìn)行一一復(fù)合。假設(shè)兩個(gè)藥物間不存在交互作用，則根據(jù)兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線估算兩者復(fù)合物的抑菌圈直徑，具體估算方法如下：a和b藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為①y=a1lg(C)+b1和②y=a2lg(C)+b2，而a和b藥物在復(fù)合物中的質(zhì)量濃度分別為C1和C2，則復(fù)合前它們的抑菌直徑分別為y1和y2，即③y1=a1lg(C1)+b1和④y2=a2lg(C2)+b2，而a藥物形成直徑為y2的抑菌圈時(shí)其質(zhì)量濃度為C3，⑤C3=10[(y2-b1)/a1]；b藥物形成直徑為y1的抑菌圈時(shí)質(zhì)量濃度為C4，⑥C4=10[(y1-b2)/a2]，則復(fù)合物形成的抑菌圈直徑應(yīng)介于⑦y3=a1lg(C1+C3)+b1和⑧y4=a2lg(C1+C4)+b2之間。采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定復(fù)合物體外抗哈維氏弧菌活性。如果測(cè)定的抑菌圈直徑小于y3和y4，則a和b藥物間存在拮抗效應(yīng)；如果大于y3和y4，a和b藥物間存在協(xié)同抗菌作用。

1.2.4 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法中草藥提取液與抗生素復(fù)合比

以篩出的中草藥水提液及其具有協(xié)同抗菌作用抗生素的含量作為考察因素，進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，然后以抑菌圈直徑作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響和各因素之間的交互作用，以尋找各因素之間的最佳復(fù)合比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗哈維氏弧菌中草藥篩選結(jié)果

瓊脂擴(kuò)散法分別測(cè)定生藥質(zhì)量濃度為100 mg/mL的7種中草藥水提液體外抗哈維氏弧菌活性，結(jié)果顯示，大黃、金銀花和黃連的水提液具有明顯的抑菌圈，其直徑分別為(10.06±0.08)、(7.05±0.08) mm和(7.00±0.06) mm，選擇體外抑菌活性最好的大黃水提液進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

大黃水提液、四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素、新霉素、金霉素和鏈霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其參數(shù)見(jiàn)表1，各藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均高于0.9274，表明各藥物質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與其抑菌圈直徑間呈較好的線性關(guān)系，可用于各藥物在特定質(zhì)量濃度下抑菌圈直徑的預(yù)測(cè)。

2.3 全組合試驗(yàn)考察中草藥與抗生素之間的交互作用

采用全組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法考察大黃水提液與6種抗生素之間的交互作用，其復(fù)合方案、復(fù)合物的抑菌圈直徑估算值范圍和實(shí)際檢測(cè)值見(jiàn)表2，大黃水提液與四環(huán)素、土霉素和強(qiáng)力霉素之間有著較強(qiáng)的協(xié)同抗菌作用，尤其與土霉素之間的交互作用非常顯著，促進(jìn)效率達(dá)到了57.42%。而這3種抗生素均同屬于四環(huán)素類抗生素。大黃水提液與新霉素、金霉素和鏈霉素之間無(wú)顯著交互作用。

表1 各藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及其參數(shù)

表2 全組合試驗(yàn)方案及其試驗(yàn)結(jié)果

2.4 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法考察中草藥與抗生素復(fù)合后的交互作用

以大黃水提液、四環(huán)素、土霉素和強(qiáng)力霉素質(zhì)量濃度為考察因素，進(jìn)行四因素三水平的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，其因素水平見(jiàn)表3，其設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

以抑菌圈直徑作為響應(yīng)值(y)，各藥物的質(zhì)量濃度編碼值作為變量，采用SAS RSREG程序?qū)υ囼?yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，回歸模型為y=15.2157+0.4258x1+0.1105x2+0.2268x3+0.4728x4-0.5484x12+0.1018x1x2-0.0080x1x3-0.1183x1x4-0.0044x22+0.2378x2x3+0.4055x2x4+0.0786x32-0.4533x3x4-0.2289x42

模型的相關(guān)系數(shù)為0.8239，說(shuō)明響應(yīng)值82.39%信息量是由所選變量引起的，采用F檢驗(yàn)方法對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，其Pr>F值為0.0104，表明模型顯著可靠。采用F檢驗(yàn)方法對(duì)模型中各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5，在設(shè)計(jì)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大黃水提液(x1)、土霉素(x3)和強(qiáng)力霉素(x4)的質(zhì)量濃度對(duì)抑菌圈直徑(y)影響顯著，大黃水提液和強(qiáng)力霉素的質(zhì)量濃度影響為極顯著，而四環(huán)素(x2)在設(shè)計(jì)的低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)抑菌圈直徑(y)的影響并不顯著。Pr>F(x1x2)、Pr>F(x1x3)、和Pr>F(x1x4)均大于0.1，表明低質(zhì)量濃度的3種抗生素對(duì)大黃水提液的抑菌活性的促進(jìn)作用并不顯著，而x2x3和x2x4的系數(shù)為正，表明四環(huán)素對(duì)土霉素和強(qiáng)力霉素有一定促進(jìn)作用，但x3x4系數(shù)為負(fù)，且Pr>F(x1x4)<0.05，表明土霉素與強(qiáng)力霉素之間呈顯著交互抑制作用。

表3 大黃水提液與抗生素復(fù)合中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表

表4 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表5 響應(yīng)面分析結(jié)果

兩兩藥物之間交互作用的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖1～圖6，可以直觀的觀察到兩兩藥物之間對(duì)響應(yīng)值的影響，由圖1可知，抑菌圈直徑(y)沿著大黃水提液(x1)的坐標(biāo)軸由低質(zhì)量濃度至高質(zhì)量濃度變化呈拋物線狀，先增后降，而響應(yīng)曲面與四環(huán)素(x2)坐標(biāo)軸呈平行態(tài)，故在設(shè)計(jì)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，四環(huán)素的質(zhì)量濃度對(duì)y基本無(wú)影響，而其等高線圖呈半橢圓形，其軸線與坐標(biāo)軸呈幾乎平行態(tài)，故大黃水提液與四環(huán)素在考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)交互作用不顯著；由圖2可知，抑菌圈直徑(y)沿著大黃水提液(x1)的坐標(biāo)軸變化趨勢(shì)與圖1基本一致，而沿著土霉素(x3)坐標(biāo)軸，隨著土霉素質(zhì)量濃度增加，抑菌圈直徑(y)也在不斷增加，而等高線與圖1類似，故大黃水提液與土霉素在考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)交互作用也不顯著；圖3響應(yīng)曲面所呈規(guī)律與圖2相類似，大黃水提液與強(qiáng)力霉素在考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)交互作用也不顯著；圖4與圖5的響應(yīng)曲面都是沿著(-1，-1)至(1，1)直線劇增，至高區(qū)域在(1，1)附近，其等高線也呈半橢圓形，其軸線與(-1，-1)至(1，1)直線幾乎平行，四環(huán)素(x2)與土霉素(x3)、強(qiáng)力霉素(x4)之間存在著交互促進(jìn)作用；相反，圖6響應(yīng)曲面都是沿著(-1，-1)至(1，1)直線劇降，至低區(qū)域在(1，1)附近，其等高線也呈半橢圓形，其軸線與(-1，-1)至(1，1)直線幾乎平行，土霉素(x3)與強(qiáng)力霉素(x4)之間存在著顯著的交互抑制作用。

通過(guò)以上分析，表明各藥物之間的關(guān)系較為復(fù)雜，采用模式搜索方法對(duì)響應(yīng)模型最優(yōu)化配方進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示，在模型可預(yù)測(cè)范圍內(nèi)，大黃水提液與四環(huán)素、土霉素和強(qiáng)力霉素的最佳配比為45∶0.07∶0.12∶0.10，在此最佳復(fù)合方案下，模型預(yù)測(cè)其抑菌圈直徑(y)為16.07 mm。

圖1 y=f(x1, x2)的響應(yīng)面和等高線

圖2 y=f(x1, x3)的響應(yīng)面和等高線

圖3 y=f(x1, x4)的響應(yīng)面和等高線

圖4 y=f(x2, x3)的響應(yīng)面和等高線

圖5 y=f(x2, x4)的響應(yīng)面和等高線

圖6 y=f(x3, x4)的響應(yīng)面和等高線

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用響應(yīng)面法對(duì)大黃與抗生素的復(fù)合方案進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果，大黃水提液∶四環(huán)素∶土霉素∶強(qiáng)力霉素=45∶0.07∶0.12∶0.10，在此最佳復(fù)合方案下，模型預(yù)測(cè)其抑菌圈直徑(y)為16.07 mm，在最佳的復(fù)合方案下進(jìn)行平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，抑菌圈直徑(y)為(15.90±0.09) mm，與預(yù)測(cè)值間相對(duì)誤差為1.06%，表明該方法確實(shí)可行。

3 討 論

文獻(xiàn)報(bào)道[16-20]，大黃提取液有顯著的體外抗哈維氏弧菌活性，其最小抑菌質(zhì)量濃度為0.24～50 mg/mL，本試驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)7種中草藥水提液體外抗哈維氏弧菌活性，試驗(yàn)結(jié)果顯示，同為100 mg/mL質(zhì)量濃度下大黃水提液抗哈維氏弧菌抑菌圈最大[(10.06±0.08) mm]，其最小抑菌質(zhì)量濃度低于25 mg/mL(大黃水提液標(biāo)準(zhǔn)曲線最低質(zhì)量濃度)，與上述的文獻(xiàn)報(bào)道基本相符。中草藥與抗生素聯(lián)合應(yīng)用，是解決中草藥起效慢和對(duì)重癥或急癥療效不顯著、抗生素耐藥機(jī)率高和藥物殘留等難題的有效途徑之一，然而并非所有中草藥和抗生素間均存在協(xié)同作用，甚至很多情況下兩者之間存在明顯的拮抗作用，為此中草藥與抗生素配伍使用必須先考察兩者間的交互作用[21]。目前常采用的方法有棋盤法、時(shí)間—?dú)⒕€方法和瓊脂擴(kuò)散法，然而棋盤法因采用微孔板作為病原菌培養(yǎng)容器，培養(yǎng)容量小，病原菌生長(zhǎng)受外界因素干擾大，結(jié)果準(zhǔn)確度難以得到保障，而且僅限于考察兩兩藥物之間的交互作用[22-23]；而時(shí)間—?dú)⒕€較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力[24-25]。為此本研究采用操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠的瓊脂擴(kuò)散法考察兩兩藥物之間的交互作用[26]，結(jié)果顯示，在較高質(zhì)量濃度下四環(huán)素類抗生素土霉素(0.27 mg/mL)、強(qiáng)力霉素(0.20 mg/mL)和四環(huán)素(0.13 mg/mL)分別對(duì)大黃水提液(生藥質(zhì)量濃度67 mg/mL)的體外抗哈維氏弧菌活性具有促進(jìn)作用，而氨基糖苷類抗生素鏈霉素和新霉素對(duì)大黃水提液的抗哈維氏弧菌體外抑制活性沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用，張玉國(guó)[27]研究表明，25～100 mg/mL大黃水提液可使大腸桿菌(Escherichiacoli)的四環(huán)素最小抑菌質(zhì)量濃度降低1～3個(gè)梯度，本試驗(yàn)研究結(jié)果與該結(jié)果基本吻合。采用中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法考察大黃水提液、土霉素、強(qiáng)力霉素和四環(huán)素組合后兩兩藥物之間的抗菌交互作用。姚遠(yuǎn)等[28]成功采用響應(yīng)面法考察了乳酸鈉、茶多酚與殼聚糖對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)抑制作用間的交互作用，發(fā)現(xiàn)三者對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果由大到小為乳酸鈉、殼聚糖、茶多酚；乳酸鈉和茶多酚存在明顯的拮抗作用；乳酸鈉和殼聚糖存在明顯的協(xié)同作用；而茶多酚和殼聚糖之間交互作用不顯著，并獲得乳酸鈉和殼聚糖最佳復(fù)合配比為62.5∶3.17。而本研究結(jié)果顯示土霉素(0.06～0.27 mg/mL)、四環(huán)素(0.01～0.07 mg/mL)和強(qiáng)力霉素(0.05～0.11 mg/mL)在低質(zhì)量濃度情況下對(duì)大黃水提液(10～50 mg/mL)的抗哈維氏弧菌的體外抑制活性無(wú)顯著的促進(jìn)作用，這與報(bào)道的大黃提取液(2 mg/mL)與四環(huán)素(5 μg/mL)對(duì)弧菌發(fā)光抑制作用為加和作用結(jié)果[29]相符；響應(yīng)面法分析表明，土霉素與強(qiáng)力霉素體外抗哈維氏弧菌活性時(shí)存在著顯著的交互抑制作用。經(jīng)過(guò)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化，獲得大黃、四環(huán)素、土霉素和強(qiáng)力霉素的最佳復(fù)合比，并根據(jù)模型給出預(yù)測(cè)值，在最佳復(fù)合方案下進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，得出該方法確實(shí)可行的結(jié)論，在中草藥和抗生素聯(lián)合用藥研究方面提供新的思路和方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

大黃主要抑菌成分為蒽醌類化合物，其抗菌機(jī)制主要包括通過(guò)抑制病原菌細(xì)胞線粒體呼吸電子傳遞；抑制菌體糖及糖代謝中間產(chǎn)物的氧化和脫氫過(guò)程，影響組織細(xì)胞生命活動(dòng)所需能源的供應(yīng)；與DNA結(jié)合，干擾其模板功能，抑制蛋白質(zhì)和核酸合成；降低生物膜的穩(wěn)定性，干擾能量代謝的酶促反應(yīng)等[20]。四環(huán)素類抗生素通過(guò)與細(xì)菌胞內(nèi)核糖體30S亞基形成可逆結(jié)合體，抑制蛋白質(zhì)合成；也可通過(guò)結(jié)合線粒體70S亞基，抑制線粒體蛋白質(zhì)的合成[30]。大黃與四環(huán)素作用機(jī)制和靶位不同，這可能是兩者之間存在協(xié)同抗哈維氏弧菌的原因，然而兩者的協(xié)同抗菌機(jī)制仍需進(jìn)一步研究確定。雖然本研究結(jié)果表明，大黃水提液與四環(huán)素體外具有協(xié)同抗哈維氏弧菌作用，但兩者聯(lián)合應(yīng)用于防治哈維氏弧菌引發(fā)的動(dòng)物疾病還需結(jié)合藥物動(dòng)力學(xué)與藥效學(xué)等多因素進(jìn)行研究。