牦牛奶酪中產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌菌株的篩選

楊吉霞，賀稚非，陳宗道

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

牦牛奶酪中產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌菌株的篩選

楊吉霞，賀稚非*，陳宗道

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

本研究用分離自西藏、新疆、云南地區(qū)牦牛奶酪的39 株乳酸菌作為供試菌株，制備細(xì)菌素粗提液，用瓊脂井法分析粗提液對(duì)9 株致病菌（蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌O157：H7、單增李斯特菌、費(fèi)氏檸檬酸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、宋內(nèi)志賀菌）和2 株非致病菌（無(wú)害李斯特菌、嗜熱鏈球菌）指示菌株的抑菌作用。測(cè)定結(jié)果表明有30 株菌的細(xì)菌素粗提液對(duì)指示菌株有抑菌作用，篩選出Y13、X29和X30這3 株抑菌譜較寬的細(xì)菌素產(chǎn)生菌。

乳酸菌；牦牛奶酪；細(xì)菌素；致病菌

細(xì)菌素是某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽［1］。部分乳酸菌能夠產(chǎn)生主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和一些親緣關(guān)系相近的乳酸菌種類有抑制作用的細(xì)菌素［2］。乳酸菌是食用安全的微生物（generally recognized as safe，GRAS），它們產(chǎn)生的細(xì)菌素也是安全的，允許應(yīng)用于食品中［3］。目前細(xì)菌素的應(yīng)用主要有三方面：1）控制食源致病菌：乳酸菌對(duì)食品中可能污染的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等致病菌有抑制或者殺滅作用，可添加于食品中以增強(qiáng)安全性［4-9］；2）用作生物防腐劑：細(xì)菌素對(duì)乳制品和肉制品中的腐敗菌有抑制或者殺滅作用，可部分代替化學(xué)防腐劑，使加工的食品更為“天然”和“安全”［10-12］；3）益生功能：乳酸菌是益生菌最主要的菌屬，可定植于宿主腸道中，產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠拮抗腸道中的致病菌和腐敗菌，發(fā)揮一定的益生功能［13］。

目前已發(fā)現(xiàn)大約70余種乳酸菌細(xì)菌素，Nisin是唯一獲準(zhǔn)作為食品防腐劑的細(xì)菌素，在50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)較為廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)［14-15］?？偟膩?lái)說(shuō)，細(xì)菌素的抑菌譜較窄，提取制備成本比較高，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［16］。篩選抑菌活性強(qiáng)和抑菌譜寬的細(xì)菌素產(chǎn)生菌仍然是國(guó)內(nèi)外細(xì)菌素研究的主要內(nèi)容之一。

我國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品種類繁多、分布廣泛，其中蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌菌種資源，從中發(fā)掘出抑菌活性強(qiáng)和抑菌譜寬的細(xì)菌素產(chǎn)生菌，對(duì)于豐富工業(yè)菌種有重要意義。然而至今只有少數(shù)學(xué)者研究了這些乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素，例如，李遠(yuǎn)［17］從新疆酸駝乳中篩選出1 株干酪乳桿菌MLS5，其細(xì)菌素粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（Enterococcus durans）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）有抑菌作用。方芳［18］從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中鑒定出1 株戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）WH12-2-1，其細(xì)菌素對(duì)蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌作用。陳芝蘭［19］和張彥斌［20］等也分別以西藏和內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品為材料篩選和鑒定產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株。傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中積累了優(yōu)良的性能，發(fā)掘出其中抑菌活性強(qiáng)和抑菌譜寬的細(xì)菌素產(chǎn)生菌株，將不同抑菌譜的菌株搭配使用，可以起到拓寬和增強(qiáng)抗菌效果的作用。

本研究用分離自西藏、新疆、云南地區(qū)牦牛奶酪的39 株乳酸菌作為供試菌株，篩選出產(chǎn)細(xì)菌素的菌株，并對(duì)其抑菌譜進(jìn)行初步研究，以期為傳統(tǒng)乳制品中優(yōu)良菌株的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

供試菌株為分離自牦牛奶酪的39 株乳酸菌，菌株編號(hào)為1～39，數(shù)字前用字母表示采樣地點(diǎn)：T（西藏）、Y（云南）、X（新疆），如表1所示，它們的分離鑒定已在文獻(xiàn)［21］中報(bào)道。

表1　供試菌株16S rRNA序列鑒定結(jié)果Table1 Species identifications of strains isolated from yak milk cheeses by 16S rRNA sequence analysis

指示菌株為：9 株致病菌菌株：蠟樣芽孢桿菌ATCC 10876、金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌O157：H7、單增李斯特菌、費(fèi)氏檸檬酸桿菌ATCC 8090、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、陰溝腸桿菌ATCC 23355、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 3624、宋內(nèi)志賀菌；2 株非致病菌菌株：無(wú)害李斯特菌、嗜熱鏈球菌。均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

MRS液體培養(yǎng)基、腦心浸液（brain heart infusion， BHI）瓊脂、Mueller-Hinton瓊脂 青島海博生物技術(shù)公司；過(guò)氧化氫酶、蛋白酶K 美國(guó)Sigma公司；Tris堿美國(guó)Amresco公司；麥?zhǔn)媳葷峁埽∕cFarland） 生物梅里埃中國(guó)有限公司；鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、硫酸銨等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1待測(cè)菌株的細(xì)菌素提?。?2-25］

將待測(cè)乳酸菌菌株活化，并按1%體積分?jǐn)?shù)接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液25 mL，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)上清液的pH值至7.0，以排除有機(jī)酸的抗菌活性，再向上清液中加入250 mg 過(guò)氧化氫酶，使其終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，37 ℃水浴反應(yīng)2 h，以排除過(guò)氧化氫的抗菌活性，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除去菌細(xì)胞，制成無(wú)細(xì)胞的上清液（cell free supernatant，CFS），然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%飽和硫酸銨溶液沉淀CFS中的蛋白質(zhì)，混和物在4 ℃條件下攪拌2 h，4 ℃、20 000 r/min離心15 min，沉淀用5 mL 0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）重新懸浮，于3 500 D透析袋中透析24 h以脫鹽，用相同濃度磷酸鉀緩沖液作為膜外透析液，再用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，制成細(xì)菌素提取液。取50 mL MRS液體培養(yǎng)基不接種菌株，加入試劑和操作處理相同，制作空白對(duì)照，以監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基和試劑的成分是否對(duì)指示菌株有抗菌作用。

1.2.2瓊脂井法測(cè)細(xì)菌素的抑菌作用［22-25］

指示菌株用BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)。將菌株活化后按1%接種量接種于BHI培養(yǎng)液，培養(yǎng)至菌液混濁度相當(dāng)于0.5 McFarland（1.5×108CFU/mL）。取菌液100 μL與10 mL軟瓊脂（0.6%瓊脂，pH 7.0，45 ℃）混合均勻，此時(shí)菌液終濃度為1.5×106CFU/mL，平鋪于Mueller-Hinton瓊脂平板上，靜置直至軟瓊脂凝固并且干燥。用打孔器無(wú)菌操作在瓊脂上打孔（直徑7 mm），每孔加入用待測(cè)菌株制備的細(xì)菌素粗提液或者空白對(duì)照50 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h（有氧）后測(cè)抑菌圈的直徑，讀數(shù)至毫米，測(cè)量6 次取平均值，作為單次測(cè)量的結(jié)果。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)［25］

在同1.2.1節(jié)方法制備的無(wú)細(xì)胞上清液中加入10 mg/mL蛋白酶K溶液至終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，在37 ℃水浴中保持2 h后取出，用瓊脂井法再次檢測(cè)抑菌活性。

2　結(jié)果與分析

用待測(cè)菌株制備的細(xì)菌素粗提液排除了菌細(xì)胞，也排除了有機(jī)酸、過(guò)氧化氫的抑菌作用，對(duì)指示菌株做瓊脂井?dāng)U散實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照無(wú)抑菌作用，排除了培養(yǎng)基和試劑的抑菌作用，所以抑菌圈主要是由粗提液中的抑菌物質(zhì)形成的，在經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理后，抑菌作用消失，由此證實(shí)抑菌作用來(lái)自細(xì)菌素。

39 株待測(cè)菌株的細(xì)菌素粗提液對(duì)9 株致病菌和2 株非致病菌指示菌株的抑菌作用分別歸納于表2和表4，部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明：9 株菌沒(méi)有檢出抑菌作用：Y15、Y16、X22、Y18、X24、X25、Y10、Y20、X39，其余30 株菌有抑菌作用。

2.1乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)致病性指示菌株的抑菌作用

引起食品污染的微生物主要有：沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸埃希氏菌O157：H7、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌，我國(guó)對(duì)這5 種致病菌制定了限量標(biāo)準(zhǔn)［26］并且實(shí)行嚴(yán)格監(jiān)管。費(fèi)氏檸檬酸桿菌可引起尿道感染、菌血癥、嬰兒腦膜炎和其他腸外感染［27］，已經(jīng)逐步成為引發(fā)我國(guó)嬰幼兒醫(yī)源性疾病的重要病原菌［28］；陰溝腸桿菌引起嬰幼兒腹瀉的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，嚴(yán)重的感染可致新生兒化膿性胃炎［29-31］。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）將費(fèi)氏檸檬酸桿菌和陰溝腸桿菌列為“B類危險(xiǎn)生物因子”［32］，蠟樣芽孢桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的食物種類分別為乳及乳制品、米飯、調(diào)料、面粉［33］和畜禽肉類、魚類、牛奶［34］，也是常見(jiàn)的食源致病菌。

表2　乳酸菌細(xì)菌素粗提液對(duì)致病性指示菌株的抑菌譜Table2 Antimicrobial spectrum of bacteriocin-rich crude extracts from 39 lactic acid bacteria strains against pathogenic reference strains mm

圖1　39 株乳酸菌對(duì)Bacillus cerreeuuss ATCC 10876的抑菌作用照片F(xiàn)ig.1 Bacteriostatic effect of 39 lactic acid bacteria strains against Bacillus cereus ATCC 10876

由表2和圖1可知，就細(xì)菌素抗菌的廣譜性來(lái)說(shuō)，菌株Y13能夠抑制5 種致病菌：蠟樣芽孢桿菌ATCC 10876、大腸埃希菌O157：H7、單增李斯特菌、費(fèi)氏檸檬酸桿菌ATCC 8090、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311，抑菌譜最寬。菌株X29和X30能抑制4 種致病菌：蠟樣芽孢桿菌ATCC 10876、弗氏檸檬酸桿菌ATCC 8090、鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 13311、陰溝腸桿菌ATCC 23355。X27、X28、X31、X35、X36、Y9、T4、Y37 8 株菌（占待測(cè)菌株總數(shù)的26.7%）能抑制3 株致病菌，大部分菌株只對(duì)1 株（11 株菌，占28.2%）或者2 株（8 株菌，占26.7%）指示菌有抑菌作用。就菌株種類來(lái)說(shuō)，L. buchneri、L. diolivorans的菌株對(duì)指示菌都沒(méi)有抑制作用，L. kefiri的菌株抑制作用很弱，而L. fermentum、L. helveticus、P. pentosaceus對(duì)指示菌有抑制作用的菌株占100%，L. casei和L. plantarum的比例也分別達(dá)到了93.8%和80%，可見(jiàn)在這5 個(gè)菌種中產(chǎn)細(xì)菌素的菌株比例較大。

表3　細(xì)菌素粗提液分別對(duì)9 株致病性指示菌株有抑菌作用的乳酸菌菌株Table3 Summary of lactic acid bacteria strains selected for bacteriocin-rich crude extracts with inhibitory effect against each pathogenic reference strain

表3歸納了其細(xì)菌素粗提液分別對(duì)9 株致病性指示菌有抑菌作用的乳酸菌菌株。從致病菌的基本性質(zhì)來(lái)看，沙門氏菌、大腸埃希菌、費(fèi)氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌、宋內(nèi)志賀菌都是革蘭氏陰性細(xì)菌，產(chǎn)生有抑菌作用細(xì)菌素的菌株分別有15 株、7 株、7 株、2 株、1 株。一般認(rèn)為乳酸菌細(xì)菌素主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和一些親緣關(guān)系相近的乳酸菌種類有抑菌作用［35］，但是也有較多研究指出它能抑制某些革蘭氏陰性細(xì)菌，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的［36-38］。

2.2乳酸菌細(xì)菌素粗提液對(duì)非致病性指示菌株的抑菌作用

表4　乳酸菌細(xì)菌素粗提液對(duì)非致病性指示菌株的抑菌作用Table4 Antimicrobial effect of bacteriocin-rich crude extracts from 39 lactic acid bacteria strains against non-pathogenic reference strainsm

無(wú)害李斯特菌是一種革蘭氏陽(yáng)性、不產(chǎn)生孢子、桿狀、嗜冷細(xì)菌，非溶血性及非致病的微生物，通?？蓮陌褪蠝缇Ｄ?、軟奶酪中分離出來(lái)［40］。嗜熱鏈球菌是革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧、無(wú)芽孢和鞭毛的細(xì)菌，是最主要的工業(yè)發(fā)酵菌種，對(duì)人體健康有益［41］。由表4可知，在39 株乳酸菌中，僅有4 株菌可抑制無(wú)害李斯特菌：X23、Y36、Y37、Y11，其中Y36和Y37抑菌活性較強(qiáng)。所有乳酸菌細(xì)菌素對(duì)嗜熱鏈球菌都沒(méi)有抑菌活性，在發(fā)酵乳制品時(shí)，這些乳酸菌可與嗜熱鏈球菌合用，不會(huì)有抑制作用。

3　結(jié) 論

本研究用分離自西藏、新疆、云南地區(qū)牦牛奶酪的39 株乳酸菌作為供試菌株，研究了它們的細(xì)菌素粗提液對(duì)9 株致病菌和2 株非致病菌指示菌株的抑菌作用，其中有9 株菌沒(méi)有檢出抑菌作用：Y15、Y16、X22、Y18、X24、X25、Y10、Y20、X39，其余30 株菌有抑菌作用。

篩選出了3 株抑菌譜寬的細(xì)菌素產(chǎn)生菌：菌株Y13能夠抑制5 種致病菌：蠟樣芽孢桿菌ATCC 10876、大腸埃希菌O157：H7、單增李斯特菌、費(fèi)氏檸檬酸桿菌ATCC 8090、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311，抑菌譜最寬。菌株X29和X30能抑制4 種致病菌：蠟樣芽孢桿菌ATCC 10876、弗氏檸檬酸桿菌ATCC 8090、鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 13311、陰溝腸桿菌ATCC 23355。它們對(duì)無(wú)害李斯特菌和嗜熱鏈球菌都沒(méi)有抑菌作用，可應(yīng)用于食品中以防范食源致病菌。

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Screening for Bacteriocin-Producing Strains of Lactic Acid Bacteria in Yak Cheeses

YANG Jixia， HE Zhifei*， CHEN Zongdao
（Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing， College of Food Science， Southwest University，Chongqing 400715， China）

This study analyzed the bacteriocin-producing capability of 39 lactic acid bacteria strains isolated from yak cheeses collected from Tibet， Xinjiang and Yunnan province of China. The crude extracts rich in bacteriocin were prepared. Agar well-diffusion method was used to test their bacteriostatic activities against 9 pathogenic reference strains （Bacillus cereus， Staphylococcus aureus， Escherichia coli O157：H7， Listeria monocytogenes， Citrobacterfreundii， Salmonella typhimurium， Enterobacter cloacae， Clostridium perfringens， and Bacterium sonnei） as well as 2 non-pathogenic reference strains （Listeria monocytogenes and Streptococcus thermophilus）. The crude extracts of 30 out of the 39 stains exhibited bacteriostatic activities against these reference strains. Three strains， namely Y13， X29 and X30， were selected as excellent bacteriocin-producing strains with a broad antimicrobial spectrum. They hold promise for potential applications in the prevention and control of food-borne pathogenic bacteria.

lactic acid bacteria； yak cheese； bacteriocin； pathogenic strain

TS252.54

A

1002-6630（2015）03-0122-05

10.7506/spkx1002-6630-201503023

2014-04-09

2013年西南大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（SWU113035）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2009C039）

楊吉霞（1978—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：yangjx@188.com

賀稚非（1960—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：zfhe2003@yahoo.com.cn