小反芻獸疫病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立

付明哲，楊 峰，郝玉青，許信剛，張 琪*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.榆林市動物疫病預防控制中心，陜西榆林 719000)

小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PRRV)屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，羊、鹿等小型反芻類動物感染PPRV后導致以稽留熱、壞死性胃腸炎和嚴重腹瀉為主要臨床癥狀的急性接觸性傳染病小反芻獸疫，我國將該病列為一類動物疫病[1-2]。山羊和綿羊?qū)PRV最為易感，其感染后的發(fā)病率和病死率可高達100%。我國自2007年暴發(fā)小反芻獸疫，隨后全國23個省、市、自治區(qū)地區(qū)都有該病的報道，近年呈區(qū)域內(nèi)點狀散發(fā)，給我國畜牧業(yè)的發(fā)展造成了困擾[3-5]，因此，一種特異、靈敏、量化且耗時短的檢測PPRV的方法對小反芻獸疫的防控很有必要。目前實驗室檢測PPRV的最常用方法是反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法，然而在靈敏度和病毒含量測定以及檢測速度等方面尚存在一些不足[6]。實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR)憑借其簡單的操作，較高的靈敏度，良好的重復性和量化的結(jié)果以及較短的檢測時耗等優(yōu)點[7]，逐漸在實驗室的檢測中得到了廣泛的應用，尤其是費用相對較低的熒光染料法實時定量PCR[8-10]。本研究根據(jù)NCBI中登錄的PPRV的N基因設計特異性引物，建立基于Eva Green的反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測方法，以期為PPRV的臨床檢測提供一種特異、靈敏、量化及快速的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株 小反芻獸疫病毒疫苗購自新疆天康畜牧生物技術股份有限公司；羊口瘡疫苗購自山東泰豐生物有限公司；山羊痘疫苗購自山東綠都公司；羊流產(chǎn)嗜性衣原體由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)微生物實驗室分離保存；感受態(tài)細胞DH5α購自康維世紀生物科技公司。

1.1.2 待檢病料 16份臨床PPRV cDNA樣品由榆林市動物疫病預防控制中心提供，主要是2014年陜北榆林地區(qū)由農(nóng)業(yè)部國家外來動物疫病防控制中心確診的養(yǎng)殖場病料樣品提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，全部病羊按照國家相關要求處理[3,6]，確診為PPRV陰性的脾臟由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院微生物實驗室提供。

1.1.3 主要試劑 DNA Marker DL 2 000和2×TaqMaster Mix購自康維世紀生物科技公司；Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pEAST-T1克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自全式金生物公司；2×Eva Green Premix購自ABM生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 通過對比分析NCBI中登錄的小反芻獸疫病毒(HQ197753.1)的N基因序列保守序列，用Primer 5設計一對特異性引物。所設計的熒光定量特異性上游和下游引物序列分別為PPRV-F：5′-TCCATCATTACCCGTTCA-3′，PPRV-R：5′-TGTCCAAATCAGCACCAC-3′，擴增片段長度為244 bp。引物由西安擎科澤西生物公司合成，稀釋至濃度為10 μmol/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PPRV RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 取稀釋的疫苗病毒液200 μL，加1 mL Trizol試劑，使用Trizol法提RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA在-20℃存儲或進行后續(xù)試驗。

1.2.3 常規(guī)RT-PCR擴增 50 μL反應體系：2×TaqMaster Mix和模板分別為25 μL、6 μL，上、下游引物均為4 μL，雙蒸水補足。反應條件：95℃ 2 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30次循環(huán)；72℃ 2 min。

1.2.4 RT-qPCR陽性質(zhì)粒及標準模板制備 按照膠回收試劑盒回收1.2.3擴增的目的片段，并將其按照pEAST-T1克隆試劑盒構建重組質(zhì)粒菌。重組質(zhì)粒菌經(jīng)常規(guī)PCR鑒定為陽性后，將重組質(zhì)粒菌中的陽性質(zhì)粒按照試劑盒的操作步驟提取，進行測序分析。用超微量光譜分析儀測定陽性質(zhì)粒濃度，按照以下公式將濃度轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)，然后進行10-1～10-9的梯度稀釋。稀釋后的質(zhì)粒作為標準模板，放置-20℃保存?zhèn)溆??？截悢?shù)(copies/μL)=C×NA/MW，其中C為陽性質(zhì)粒測定的濃度，單位ng/μL，NA取值為6.02×1023copies/mol，MW為平均分子質(zhì)量，單位Dolton。

1.2.5 RT-qPCR擴增 10 μL反應體系：2×Eva Green Premix、標準模板、上游和下游引物分別為5 μL、1 μL、0.3 μL、0.3 μL，ddH2O補足。反應條件：95℃ 10 min：95℃ 3 s，60℃ 30 s，采集熒光信號，35次循環(huán)。

1.2.6 RT-qPCR反應標準曲線建立 選取濃度稀釋10-4～10-8的標準模板為陽性模板，以雙蒸水為陰性對照模板，進行RT-qPCR擴增。結(jié)果以實時熒光定量PCR儀(TL988)自帶軟件分析繪制擴增曲線、標準曲線和熔解曲線。

1.2.7 RT-qPCR特異性試驗 用建立的RT-qPCR方法分別檢測PPRV、羊口瘡病毒(ORFV)、山羊痘病毒(GTPV)、羊流產(chǎn)嗜性衣原體的cDNA或者DNA，驗證建立的RT-qPCR方法的特異性。

1.2.8 RT-qPCR靈敏性試驗 選取濃度稀釋了10-6～10-10的標準模板為陽性模板，雙蒸水為陰性對照模板，RT-qPCR方法擴增。選取濃度稀釋了10-6～10-9的標準模板為陽性模板，雙蒸水為陰性對照模板，常規(guī)PCR方法擴增。通過比較兩種方法可以檢測到陽性結(jié)果的最低濃度，以此得出靈敏程度。

1.2.9 RT-qPCR重復性試驗 分別以同一批次104～106copies/μL濃度的標準模板和不同批次104～106copies/μL濃度的標準模板為陽性模板，用雙蒸水作為陰性對照模板，進行RT-qPCR擴增，計算組內(nèi)和組間變異系數(shù)。

1.2.10 臨床樣品的檢測 取16份臨床PPRV RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品做待測樣本，以標準模板做陽性對照模板，以雙蒸水為陰性對照模板，用所建立的RT-qPCR方法檢測。

2 結(jié)果

2.1 陽性質(zhì)粒PCR鑒定

將菌液用熒光定量特異性引物進行PCR檢測，結(jié)果為244 bp目的片段(圖1)。將鑒定為陽性的質(zhì)粒測序，通過Blast比對，結(jié)果同源性達100%，說明重組質(zhì)粒構建成功。

M.DNA標準DL 2 000；1.陽性質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；2.陰性對照

M.DNA Maker DL 2 000; 1.PCR products of positive plasmid; 2.Negative control

圖1陽性質(zhì)粒PCR鑒定

Fig.1 PCR identification of positive plasmid

2.2 RT-qPCR標準模板的制備

用超微量光譜分析儀測定提取質(zhì)粒的濃度為112.5 ng/μL，OD260/OD280值為1.827，計算得拷貝數(shù)為2.46×1010copies/μL，將其稀釋至濃度分別為2.46×109copies/μL、2.46×108copies/μL、2.46×107copies/μL、2.46×106copies/μL、2.46×105copies/μL、2.46×104copies/μL、2.46×103copies/μL、2.46×102copies/μL、2.46×101copies/μL、2.46×100copies/μL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 RT-qPCR反應標準曲線建立

建立標準模板的RT-qPCR擴增曲線見圖2。相應的標準曲線見圖3。其熔解曲線見圖4。在2.46×102copies/μL～2.46×107copies/μL的濃度區(qū)間內(nèi)，所得拷貝數(shù)(x)與Ct值(y)的線性方程為y=-3.39x+37.637，斜率為-3.39，截距為37.637，線性相關系數(shù)R2=0.999，顯示了良好的線性關系。熔解曲線峰型單一，無雜峰，熔解溫度一致，Tm=84.9℃。

1～6.2.46×107copies/μL～2.466×102copies/μL 6個不同濃度標準模板的qRT-PCR擴增曲線；NC.陰性對照

1-6.qRT-PCR amplification curves of 2.46×107copies/μL to 2.46×102copies/μL diluted standard template,respectively; NC.Negative control

圖2實時熒光定量PCR擴增曲線

Fig.2 The amplification curve of RT-qPCR

圖3 實時熒光定量PCR標準曲線

圖4 實時熒光定量PCR熔解曲線

2.4 RT-qPCR特異性試驗

分別以PPRV、ORFV、GTPV和羊流產(chǎn)嗜性衣原體以及確診PPRV陰性的脾臟cDNA或者DNA為模板，用建立的RT-qPCR方法擴增，結(jié)果只有PPRV有熒光信號(圖5)，說明所建立的RT-qPCR方法特異性好。

圖5 RT-qPCR特異性試驗擴增曲線

2.5 RT-qPCR靈敏性試驗

以2.46×104copies/μL～2.46×100copies/μL的標準模板為模板，進行RT-qPCR方法擴增。以2.46×105copies/μL～2.46×101copies/μL的標準模板作為模板，用常規(guī)PCR方法擴增。結(jié)果表明，RT-qPCR方法檢出限為2.46×101copies/μL(圖6)，常規(guī)PCR方法檢出限為2.46×103copies/μL(圖7)，說明建立的RT-qPCR檢測方法與常規(guī)RT-PCR相比靈敏100倍。

1～5.2.46×104copies/μL～2.46×100copies/μL 5個不同濃度標準模板的RT-qPCR擴增曲線；NC.陰性對照

1-5.RT-qPCR amplification curves of 2.466×104copies/μL to 2.466×100copies/μL diluted standard template,respectively; NC.Negative control

圖6 RT-qPCR靈敏性試驗

Fig.6 Sensitivity test of RT-qPCR

2.6 RT-qPCR重復性試驗

以2.46×106copies/μL、2.46×105copies/μL、2.46×104copies/μL的標準模板為反應模板，每個模板做3個重復，進行組內(nèi)重復試驗(表1)，每隔1周做1次，每次做3個重復，計算平均值，做3次，進行組間重復試驗(表2)。結(jié)果顯示，建立的RT-qPCR方法的變異系數(shù)在1%以下，其重復性表現(xiàn)優(yōu)異。

2.7 方法的初步應用

應用本試驗所建立的RT-qPCR檢測方法對16份臨床病料提取RNA并反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品進行檢測，并與RT-PCR作對比。檢測結(jié)果顯示， RT-PCR法檢測到陽性樣品16份，RT-qPCR方法檢測到陽性樣品也為16份，RT-qPCR方法與常規(guī)RT-PCR方法檢測結(jié)果一致。

M.DNA標準DL 2 000；1～4.2.46×105copies/μL～2.46×101copies/μL 4個不同濃度標準模板的常規(guī)PCR產(chǎn)物；NC.陰性對照

M.DNA Maker DL 2 000; 1-4.The PCR products of 2.46×105copies/μL to 2.46×101copies/μL diluted standard template; NC.Negative control

圖7 常規(guī)PCR靈敏性試驗

表2 RT-qPCR組間重復試驗

3 討論

我國小反芻獸疫盡管在2015年后已得到控制，但仍呈地方散發(fā)，通過實驗室檢測手段對早期感染和隱性帶毒者高效、快速的檢出，可以為小反芻獸疫防控與凈化提供一定的幫助。目前實驗室診斷PPRV的方法主要有病毒的分離鑒定、中和試驗、瓊脂凝膠免疫擴散試驗、ELISA、免疫熒光抗體試驗、RT-PCR等方法[11]，這些檢測方法在病原檢測方面都存在一定的缺點，如病原分離耗時長，中和試驗特異性低，瓊脂凝膠免疫擴散試驗、ELISA等方法尚無法鑒別牛瘟病毒和小反芻獸疫病毒。隨著分子生物學技術的發(fā)展，用熒光標記方法檢測特異性產(chǎn)物的實時熒光定量PCR技術，因其靈敏度高、重復性好、定量準確、耗時短、過程封閉、操作簡單、成本相對較低等眾多優(yōu)點，逐漸在病原體檢測、目的基因表達量、疫苗質(zhì)量控制等方面得到廣泛的使用。

在實時熒光定量PCR試驗過程中，要注意做好防污染工作，盡管試驗操作比較簡單，但操作中的污染如氣溶膠的污染會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；在制作標準模板時，要使陽性質(zhì)粒完全混合均勻，以此保證標準模板的濃度梯度正確性。由于熒光染料能夠被嵌入到任何脫氧核糖核酸的雙鏈間，所以RT-qPCR熒光染料法的引物在設計時要認真考慮長度、退火溫度、保守性、二聚體、發(fā)夾結(jié)構等方面的問題，尤其是其中的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構問題，其關系到定量的準確性。以上方面考慮的越周全，得到的結(jié)果越穩(wěn)定，越可靠[12]。Eva Green作為飽和熒光染料，沒有“染料重排”的缺點，熔解曲線的分辨率相對較高，而且可以在擴增過程當中及時的從DNA雙鏈中釋放出來，從而降低了對PCR擴增過程的影響，因此使用Eva Green染料定量，比使用SYBR染料準確性高。故此，本研究選取Eva Green作為RT-qPCR的熒光染料。

本研究根據(jù)NCBI上登錄的PPRV的N基因，設計了一對擴增的目的片段為244 bp的特異性引物，構建陽性質(zhì)粒標準模板，使用Eva Green作為信號報告熒光，建立PPRV RT-qPCR的檢測方法。結(jié)果表明，該檢測方法的標準曲線線性關系良好，熔解曲線峰型單一；特異性強，只能檢測出PPRV，最低檢測拷貝數(shù)為2.46×101copies/μL；重復試驗變異系數(shù)在1%之下，重復性良好；用建立的RT-qPCR方法檢測16份PPRV的陽性樣本，結(jié)果均為陽性；整個RT-qPCR擴增過程只需45 min，時間過程短。綜上所述，本研究建立的PPRV RT-qPCR檢測方法，具有良好的特異性、靈敏性和重復性，而且耗時短，可用于臨床檢測小反芻獸疫病毒感染，對小反芻獸疫的防控提供一定的技術支持。