禽流感病毒H7亞型RT-exoRPA檢測方法的建立

王 瀟，曹琛福，黃超華，林彥星，花群義，賈偉新

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州 510642；2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045)

禽流感是由禽流感病毒引起的一種急性、高度接觸性的傳染病。不同年齡、品種的家禽感染禽流感病毒后，會表現(xiàn)出不同的臨床癥狀[1-2]。根據(jù)禽流感病毒毒力強度的不同可分為高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒，禽流感病毒H7亞型屬于高致病性禽流感病毒。2013年，一種新的可感染人的禽流感病毒H7N9在我國長江三角洲地區(qū)暴發(fā)。自禽流感病毒H7N9暴發(fā)以來，禽流病毒感染導致人死亡的案例越來越多，對我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和社會的安定造成了極大的危害[3]。2017年，我國因感染禽流感病毒H7N9死亡的人數(shù)又急劇上升，再次引起了大家的關(guān)注。因此，建立一種快速檢測禽流感病毒H7亞型的方法對我國養(yǎng)禽業(yè)及公共衛(wèi)生事業(yè)具有重要意義。

目前常用病毒分離法和PCR方法檢測禽流感病毒H7亞型，但是這些方法無法運用于現(xiàn)場檢測，同時操作復雜，且耗時長。2006年，Piepenburg O等[4-6]報道了重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification,RPA)技術(shù)，該技術(shù)操作簡單且快速，在37℃～42℃恒溫條件下，20 min即能完成核酸的擴增，得到檢測結(jié)果。英國TwistDx公司開發(fā)出了商品化試劑盒，反應酶是以凍干粉形式儲存，促進了重組酶聚合酶擴增技術(shù)進一步發(fā)展，實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。本試驗通過選取禽流感病毒H7亞型的HA基因保守序列為靶標，建立檢測禽流感病毒H7亞型的RT-exoRPA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀，ABI公司產(chǎn)品；超微量核酸蛋白濃度分析儀，BioDrop公司產(chǎn)品；磁珠法核酸提取純化系統(tǒng)，病毒RNA抽提試劑盒MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit(AM1836)，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；T16-ISO等溫擴增熒光檢測儀，TwistAmpTM EXO試劑盒，TwistDx公司產(chǎn)品；實時熒光PCR反應母液，Ambion公司產(chǎn)品。

1.1.2 樣品 禽流感病毒H1亞型、H3亞型、H4亞型、H5亞型、H7亞型、H9亞型和H11亞型，新城疫病毒均為滅活病毒，35份臨床樣品均來自華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院禽病研究室。

1.2 方法

1.2.1 引物探針的設(shè)計與合成 選用最近流行的禽流感病毒H7亞型毒株的HA基因保守序列，根據(jù)RPA要求設(shè)計多對引物和探針，在HA基因保守區(qū)段自主設(shè)計多對引物及探針，并經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST驗證其特異性，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成與標記，其中在IVP-exoRPA探針上需要作如下標記：第32個堿基修飾BHQ1-dT，第36個堿基修飾6-FAM-dT，第34個堿基替換為dSpacer，3′端修飾C3 Spacer。

1.2.2 病毒RNA的提取及濃度測定 按Thermo病毒RNA抽提試劑盒(MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit，AM1836)說明于全自動磁珠提取純化系統(tǒng)上提取禽流感病毒H1亞型、H3亞型、H4亞型、H5亞型、H7亞型、H9亞型和H11亞型、新城疫病毒的核酸，利用超微量核酸蛋白濃度分析儀測定核酸濃度。

1.2.3 RT-exoRPA反應體系及反應條件 將29.5 μL溶解緩沖液(rehydration buffer)，2.1 μL 10 μmol 的上、下游引物，0.6 μL 10 μmol的探針，13.2 μL模板及DEPC水，混勻后，加入TwistAmpTMexo試劑盒中裝有白色固體凍干混合酶顆粒的RPA反應管中，最后再加入2.5 μL 280 mmol醋酸鎂，共50 μL體系。將配置好的反應體系置于T16-ISO儀器中，在37℃～42℃反應5 min后，取出混勻后，重新放入T16-ISO儀器中繼續(xù)反應15 min。同時在整個反應過程中收集FAM熒光。

1.2.4 最佳反應體系和反應條件的確定

1.2.4.1 最佳引物及探針的篩選 將多對上、下游引物及探針進行配對組合，配置反應體系，加入模板為同一禽流感病毒H7亞型核酸，進行特異性試驗和靈敏性試驗，篩選出最佳組合。

1.2.4.2 最佳反應溫度的確定 將反應溫度分別設(shè)置為37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃共6個不同溫度進行試驗，篩選出最佳的反應溫度。

1.2.5 檢測禽流感病毒H7亞型RT-exoRPA方法的特異性試驗 按優(yōu)化好的條件，以禽流感病毒H1亞型、H3亞型、H4亞型、H5亞型、H7亞型、H9亞型、H11亞型、新城疫病毒為模板，進行特異性擴增，檢測其特異性。

1.2.6 檢測禽流感病毒H7亞型RT-exoRPA方法的靈敏性試驗 將禽流感病毒H7亞型核酸10倍倍比稀釋后，用RT-exoRPA方法進行靈敏性試驗并與實時熒光定量PCR方法進行比較，以新城疫病毒核酸為陰性對照。實時熒光定量PCR方法反應體系包括：2×RT-PCR buffer 12.5 μL，5×RT-PCR酶1 μL，上、下引物各1 μL，探針0.4 μL，最后加DEP水及模板至25 μL。引物及探針為采用國家標準《禽流感H7亞型熒光RT-PCR檢測方法》(GB/T 19438.3-2004)推薦的核苷酸序列。反應程序：45℃ 10 min，1個循環(huán)；95℃ 10 min，1個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 45 s(收集熒光FAM)，40個循環(huán)。

1.2.7 臨床試驗 利用本文所建立檢測方法對采自某家禽交易市場35份咽拭子樣品進行檢測，以H7亞型禽流感病毒核酸為陽性對照，新城疫病毒核酸為陰性對照，同時，用實時熒光RT-RPA方法對該批樣品進行檢測，比較兩者的符合性。

2 結(jié)果

2.1 最佳反應體系和反應條件的確定

通過靈敏性試驗和特異性試驗對引物及探針進行篩選，最終確定最佳引物探針的核酸序列見表1。表格中IVP-exoRPA 探針修飾標記為：①第32個堿基修飾BHQ1-dT；②第36個堿基修飾6-FAM-dT；③第34個堿基替換為dSpacer；④3′端修飾C3 Spacer。用同一禽流感病毒H7亞型核酸作為模板進行試驗，篩選最佳反應溫度。試驗結(jié)果表明將反應溫度設(shè)置為40℃時，其熒光吸收值增長率最高，因此40℃為最佳反應溫度。

表1 RT-exoRPA方法最佳引物及探針核苷酸序列

2.2 RT-exoRPA方法靈敏性結(jié)果

將禽流感病毒H7亞型進行10倍倍比稀釋，即其核酸濃度為0.24 μg/mL至0.24×10-5μg/mL，分別用實時熒光定量PCR和RT-exoRPA兩種檢測方法進行靈敏性試驗。 實時熒光定量PCR靈敏性試驗檢測結(jié)果顯示(圖1)，有6條標準“S”曲線出現(xiàn)，其禽流感病毒H5亞型核酸濃度分別為：0.24、0.24×10-1、0.24×10-2、0.24×10-3、0.24×10-4、0.24×10-5μg/mL，對應的CT值分別為：19.2、23.0、27.2、30.2、34.0、37.3 。根據(jù)試劑盒中陰陽性判定標準：當CT<35，并出現(xiàn)標準“S”曲線時判為陽性，當CT≥35時判為陰性。因此在本次試驗中實時熒光定量PCR方法最低可檢測到核酸濃度為0.24×10-4μg/mL。RT-exoRPA靈敏性試驗檢測結(jié)果顯示(圖2)，樣品濃度為0.24、0.24×10-1、0.24×10-2、0.24×10-3μg/m時，出現(xiàn)核酸擴增曲線，因此，在本次試驗中RT-exoRPA方法最低可檢測到核酸濃度為0.24×10-3μg/mL。結(jié)果表明RT-exoRPA方法靈敏性比實時熒光定量PCR方法低一個數(shù)量級。但RT-exoRPA方法檢測時間只需要20 min，在5 min可觀察到擴增曲線，而實時熒光定量PCR方法檢測時間為88 min，因此RT-exoRPA方法更為快速。

2.3 RT-exoRPA方法特異性結(jié)果

按優(yōu)化好的條件，驗證該方法的特異性。結(jié)果顯示(圖3)，只有禽流感病毒H7亞型樣品出現(xiàn)擴增曲線，而其樣品均無擴增曲線。因此本文建立的檢測禽流感病毒H7亞型RT-exoRPA檢測方法特異性強。

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果

將35份田間樣品提取核酸后，按本文建立的RT-exoRPA檢測方法和實時熒光定量PCR方法分別進行檢測，RT-exoRPA方法檢測結(jié)果(圖4～圖9)顯示，有10份樣品為陽性，其余25份樣品為陰性，與實時熒光定量PCR方法檢測結(jié)果一致，表明兩種方法符合率100%。

1～6.禽流感病毒H7亞型核酸濃度分別為0.24、0.24×10-1、0.24×10-2、0.24×10-3、0.24×10-4、0.24×10-5μg/mL；7.陰性對照

1-6.H7 subtype avian influenza virus nucleic acid concentrations 0.24,0.24×10-1，0.24×10-2,0.24×10-3,0.24×10-4,0.24×10-5μg/mL;7.Negative control

圖1實時熒光定量PCR方法檢測結(jié)果

Fig.1 Detection results of real-time PCR method

1～6.禽流感病毒H7亞型核酸濃度分別為 0.24、0.24×10-1、0.24×10-2、0.24×10-3、0.24×10-4、0.24×10-5μg/mL；7.陰性對照

1-6.H7 subtype avian influenza virus nucleic acid concentrations:0.24,0.24×10-1，0.24×10-2,0.24×10-3,0.24×10-4,0.24×10-5μg/mL;7.Negative control

圖2 RT-exoRPA方法檢測結(jié)果

Fig.2 Detection results of RT-exoRPA method

3 討論

禽流感一直威脅著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，特別是高致病性禽流感更是造成我國大批家禽死亡，如今部分禽流感亞型甚至已經(jīng)威脅到了人類的健康，影響到了社會的安定。當前我國H7亞型禽流感流行毒株復雜多樣，給我國養(yǎng)禽業(yè)疫病的防控帶來了挑戰(zhàn)[7]。若能做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早控制，則可有效阻止疫病的傳播以及減少經(jīng)濟損失。

1.禽流感病毒H1亞型；2.禽流感病毒H3亞型；3.禽流感病毒H4亞型；4.禽流感病毒H5亞型；5.禽流感病毒H7亞型；6.禽流感病毒H9亞型；7.禽流感病毒H11亞型；8.新城疫病毒

1.H1 subtype avian influenza virus;2.H3 subtype avian influenza virus;3.H4 subtype avian influenza virus;4.H5 subtype avian influenza virus;5.H7 subtype avian influenza virus;6.H9 subtype avian influenza virus;7.H11 subtype avian influenza virus;8.Newcastle disease virus

圖3 RT-exoRPA檢測特異性結(jié)果

Fig.3 Specificity detection results of RT-exoRPA method

1～6.待檢樣品1號～6號；7.陰性對照；8.陽性對照1-6.Samples 1-6；7.Negative control；8.Positive control

1～6.待檢樣品7號～12號；7.陰性對照；8.陽性對照1-6.Samples 7-12；7.Negative control；8.Positive control

1～6.待檢樣品13號～18號；7.陰性對照；8.陽性對照1-6.Samples 13-18；7.Negative control；8.Positive control

1～6.待檢樣品19號～24號；7.陰性對照；8.陽性對照1-6.Samples 19 -24；7.Negative control；8.Positive control

1～6.待檢樣品25號～30號；7.陰性對照；8.陽性對照1-6.Samples 25-30；7.Negative control；8.Positive control

目前診斷禽流感病毒H7亞型的方法很多，實驗室常用病毒分離法診斷禽流感病毒H7亞型，但是該方法耗時長；普通RT-PCR方法和實時熒光定量PCR方法，依賴溫度變化才能擴增，不適合現(xiàn)場診斷[8]；RT-PLAMP方法，雖在恒溫條件下即可擴增，但該方法引物設(shè)計復雜，且需要多對[9]。因此，建立一種簡單、快速檢測禽流感病毒H7亞型的方法具有重要的公共衛(wèi)生學意義。

RPA一種新型的恒溫擴展核酸檢測方法，其工作原理是模仿機體內(nèi)核酸復制機制，通過一些特殊的重組蛋白(酶)，讓DNA雙螺旋解鏈后，又通過幫助聚合酶復制DNA達到擴增的目的[10]。

1～5.待檢樣品31號～35號；6.陰性對照；7.陽性對照1-5.Samples 31-35；6.Negative control；7.Positive control

由于RPA技術(shù)克服了實時熒光定量PCR依賴變溫才能得到擴增的特點以及具有操作簡單、反應快速，且反應酶可以干粉形式保存[9]等特點。自2006年，RPA技術(shù)問世以來，該技術(shù)先已廣泛應用于各個領(lǐng)域[12-15]。

本文根據(jù)禽流感病毒H7亞型HA基因保守序列，設(shè)計多對引物探針，通過篩選后構(gòu)建了快速檢測禽流感病毒H7亞型RT-exoRPA方法，并對其特異性和靈敏性也進行了驗證，結(jié)果表明，該方法具有簡便、快速、特異、靈敏等特點。在靈敏性試驗中，RT-exoRPA方法的靈敏性比實時熒光定量PCR方法相差一個數(shù)量級，可能與RT-exoRPA在擴增體系中一些蛋白酶的干擾所產(chǎn)生[16]，也可能與設(shè)計的引物探針不夠靈敏有關(guān)。相信在RPA檢測技術(shù)的不斷研究中，這些問題能得到改善，將RPA檢測方法更好地運用于現(xiàn)場快速檢測中。