STAT3和STAT4基因單核苷酸多態(tài)性與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性

范敬靜 常彩芳 王浩

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染科（河北張家口075000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤第五位和第三位［1］。全球范圍內(nèi)每年新發(fā)HCC病例約63萬(wàn)例，其中超過(guò)一半發(fā)生在中國(guó)［4］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4（signal transducers and activators of transcription 4，STAT4）在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡調(diào)控過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［3-4］。近年研究發(fā)現(xiàn)STAT3基因rs2293152位點(diǎn)和STAT4基因rs7574865位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）可影響個(gè)體 HCC 的遺傳易感性［5-8］。但rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與環(huán)境因素在HCC發(fā)病中是否存在交互作用，目前國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究擬采用病例對(duì)照研究方法，探究rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與HCC遺傳易感性的關(guān)聯(lián)及與環(huán)境因素的交互作用，以期為HCC防治提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)1∶1配比病例對(duì)照研究方法，選取2013年1月至2017年12月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院診治的經(jīng)肝組織病理切片確診的新發(fā)HCC患者256例作為觀察組。依據(jù)性別、年齡（±3歲）與觀察組病例進(jìn)行頻數(shù)匹配的原則，選取同期在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院體檢的健康人群256例作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2DNA提取和SNPs檢測(cè)采集所有研究對(duì)象空腹外周靜脈血5 mL，DNA提取使用血液基因組柱式提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）。SNPs檢測(cè)使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)。PCR擴(kuò)增引物：STAT3基因rs2293152位點(diǎn)正向引物序列 5′-TCCCCTGTGATTCAGATCCC-3′、反向引物序列 5′-CATTCCCACATCTCTGCTCC-3′；STAT4基因rs7574865位點(diǎn)正向引物序列5′-AAAGAAGTGGGATAAAAAGAAGTTTG-3′、反向引物序列 5′-CCACTGAAATAAGATAACCACTGT-3′。PCR 反應(yīng)體系包括：模板DNA 100 ng，正向、反向引物各0.5 μmol，MgCl21.5 mmol，Taq DNA聚合酶0.65 U，dNTP 0.2 mmol，總反應(yīng)體系為25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。對(duì)rs2293152、rs7574865位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物分別加入HpaII和HpaI內(nèi)切酶。產(chǎn)物使用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外分析儀下觀察并記錄結(jié)果，同時(shí)從研究的DNA樣本隨機(jī)抽取5%進(jìn)行重檢，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3資料收集根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料，由經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的研究人員收集所有研究對(duì)象的一般人口學(xué)信息及HCC環(huán)境危險(xiǎn)因素，包括年齡、性別、吸煙、飲酒、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染及HCC家族史。吸煙定義為累積吸煙＞100支或超過(guò)3年每周至少1 d以上（＞15 min/d）吸入香煙燃燒所產(chǎn)生的煙霧［9］；飲酒定義為連續(xù)或累積飲酒時(shí)間超過(guò)6個(gè)月，平均每日攝入酒精量≥50 g，酒精攝入量＝酒精度×攝入體積×0.8；HCC家族史定義為研究對(duì)象的一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)親屬中有HCC患者［10］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用Student'st檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Haploview 4.2軟件檢驗(yàn)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。采用二分類Logistic回歸模型分析rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與HCC遺傳易感性的關(guān)聯(lián)及與環(huán)境因素間的交互作用，以比值比（odds ratio，OR）及95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）來(lái)表示關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組間一般資料比較兩組在年齡、性別構(gòu)成方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在吸煙、飲酒、HBV感染及HCC家族史方面，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2兩組間rs2293152、rs7574865位點(diǎn)基因型分布比較兩組rs2293152、rs7574865位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（rs2293152：χ2＝0.432，P＝0.511；rs7574865：χ2＝0.112，P＝0.737），具有群體代表意義。兩組間rs2293152、rs7574865位點(diǎn)基因型分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 兩組間一般資料比較Tab.1 Distributions of general clinical characteristics in the two groups 例（%）

表2 兩組間rs2293152、rs7574865位點(diǎn)基因型分布比較Tab.2 Genotypes frequency distribution of rs2293152，rs7574865 between the two groups 例（%）

2.3rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與HCC遺傳易感性關(guān)聯(lián)分析經(jīng)二分類Logistic回歸模型校正年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染、HCC家族史后發(fā)現(xiàn)，與rs2293152位點(diǎn)CC基因型相比，GG型可顯著增加HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝1.682，95%CI：1.206～3.445，P＝0.031）；與GC+CC基因型相比，GG型亦可顯著增加HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝2.201，95%CI：1.694～3.815，P＝0.028）；與C等位基因相比，G等位基因可顯著增加HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝1.328，95%CI：1.039～1.654，P＝0.021）。與rs7574865位點(diǎn)TT基因型相比，GG型可顯著增加HCC 的 發(fā) 病風(fēng) 險(xiǎn)（OR＝1.761，95%CI：1.027～3.020，P＝0.040）；與GT+TT基因型相比，GG型亦可顯著增加HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝2.333，95%CI：1.209～4.503，P＝0.012）；與T等位基因相比，G等位基因可顯著增加HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝1.409，95%CI：1.057～1.878，P＝0.019），見(jiàn)表3。

2.4分層分析本研究基于兩組間一般資料比較結(jié)果，以吸煙、飲酒、HBV感染及HCC家族史進(jìn)行分層分析顯示，在飲酒人群中rs2293152位點(diǎn)GG基因型相比GC+CC基因型HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR＝1.923，95%CI：1.241～3.562，P＝0.044），在HBV感染人群中rs2293152位點(diǎn)GG基因型相比GC+CC基因型HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)亦顯著升高（OR＝2.216，95%CI：1.136～3.197，P＝0.031），見(jiàn)表4；在飲酒人群中rs7574865位點(diǎn)GG基因型相比GT+TT基因型HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR＝1.234，95%CI：1.051～1.448，P＝0.010），在 HBV 感染人群中rs7574865位點(diǎn)GG基因型相比GT+TT基因型HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)亦顯著升高（OR＝2.181，95%CI：1.122～4.243，P＝0.022），見(jiàn)表5。

表3 rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與HCC遺傳易感性關(guān)聯(lián)分析Tab.3 The associations between SNPs of rs229315，rs7574865 and the hereditary susceptibility of HCC 例

2.5rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與環(huán)境因素的交互作用分析經(jīng)二分類Logistic回歸模型分析rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與環(huán)境因素的交互作用發(fā)現(xiàn)，rs2293152位點(diǎn)SNPs與飲酒（OR＝1.314，95%CI：1.125～1.649，P＝0.046）及 HBV 感染（OR＝3.102，95%CI：1.014～9.487，P＝0.027）間均存在正交互作用；rs7574865位點(diǎn)SNPs與飲酒（OR＝1.085，95%CI：1.017～1.158，P＝0.013）及HBV感染（OR＝4.778，95%CI：1.687～13.535，P＝0.003）間亦均存在正交互作用，見(jiàn)表6。

表4 rs2293152位點(diǎn)分層分析結(jié)果Tab.4 Results of rs2293152 stratification analyses 例（%）

表5 rs7574865位點(diǎn)分層分析結(jié)果Tab.5 Results of rs7574865 stratification analyses 例（%）

表6 rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與環(huán)境因素的交互作用分析Tab.6 Results of gene-environment interaction analyses

3 討論

STAT家族可將細(xì)胞外信號(hào)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，其中STAT3、STAT4作為Janus激酶（JAK）/STAT信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤新生血管生成，在HCC發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［3-4］。個(gè)體遺傳背景的差異亦與HCC發(fā)病密切相關(guān)，而SNPs能充分反映個(gè)體間的遺傳差異，決定了個(gè)體對(duì)疾病的易感性，正成為研究HCC遺傳易感性的重要工具，近年研究表明STAT3基因rs2293152位點(diǎn)和STAT4基因rs7574865位點(diǎn)SNPs與HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在一定的關(guān)聯(lián)［5-6］。本研究采用病例對(duì)照研究方法，通過(guò)比較HCC患者與健康對(duì)照中rs2293152、rs7574865位點(diǎn)等位基因及基因型的差異，發(fā)現(xiàn)rs2293152位點(diǎn)G等位基因、GG基因型和rs7574865位點(diǎn)G等位基因、GG基因型均可顯著增加HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與XIE等［8］和CHANTHRA等［11］研究結(jié)果相符，表明rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與HCC遺傳易感性明顯相關(guān)。

HCC是由環(huán)境因素與遺傳因素共同作用發(fā)展而來(lái)的復(fù)雜惡性疾?。?2］，但飲酒、HBV感染等環(huán)境因素與rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs間的交互作用是否影響HCC的發(fā)病，目前尚未見(jiàn)相關(guān)的研究。飲酒與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，一方面酒中的乙醇在肝臟中代謝所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物乙醛會(huì)直接毒害肝細(xì)胞，另一方面乙醇可誘導(dǎo)微粒體乙醇氧化酶系的主要成分細(xì)胞色素P450E1活化外源性致癌物，使氧離子和過(guò)氧化氫等活性氧基團(tuán)生成增多，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致肝損傷，加速肝纖維化進(jìn)而誘發(fā)HCC［13］。本研究經(jīng)分層分析發(fā)現(xiàn)，在飲酒人群中rs2293152位點(diǎn)GG基因型相比GC+CC基因型，rs7574865位點(diǎn)GG基因型相比GT+TT基因型，HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，并通過(guò)交互作用分析進(jìn)一步指出rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與飲酒的正交互作用，能夠增加HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。HBV感染是我國(guó)HCC最主要的危險(xiǎn)因素，既可導(dǎo)致慢性乙型病毒性肝炎引起肝組織的炎癥、纖維化及壞死等間接促進(jìn)HCC發(fā)病，又能以HBV脫氧核糖核酸與肝細(xì)胞脫氧核糖核酸整合，使肝細(xì)胞基因發(fā)生突變，直接增加HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［14-16］。本研究經(jīng)分層分析發(fā)現(xiàn)，在HBV感染人群中rs2293152位點(diǎn)GG基因型相比GC+CC基因型，rs7574865位點(diǎn)GG基因型相比GT+TT基因型，HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，并通過(guò)交互作用分析進(jìn)一步指出rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs與HBV感染的正交互作用能夠增加HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，STAT3基因rs2293152位點(diǎn)和STAT4基因rs7574865位點(diǎn)SNPs與HCC遺傳易感性明顯相關(guān)，并與飲酒、HBV感染存在正交互作用，可增加HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究可提供科學(xué)的理論依據(jù)指導(dǎo)HCC進(jìn)行一級(jí)預(yù)防，對(duì)HCC高危人群開(kāi)展rs2293152、rs7574865位點(diǎn)SNPs篩查，針對(duì)rs2293152位點(diǎn)G等位基因、rs7574865位點(diǎn)G等位基因攜帶者，建議戒酒、加強(qiáng)HBV感染防控，從而遏制HCC的發(fā)病。