結(jié)直腸癌中MACC1的表達及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

邱麗湞 吳共發(fā) 劉鈺君 黃綺亭 曾宇婷 李海剛，3

廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院1體檢中心，2病理科（廣州 511300）；3中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院病理科（廣州510120）

結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，截止2014年CRC的發(fā)病率居我國惡性腫瘤的第3位，病死率位居全國惡性腫瘤的第4位［1-2］。目前，對CRC的治療以外科手術(shù)為主，采用放化療以及靶向治療等綜合治療方法，然而CRC根治術(shù)的5年生存率僅約50%，侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致患者死亡的主要原因［3］，所以，闡明CRC侵襲和轉(zhuǎn)移的具體機制，尋找特異有效的治療靶點，具有重要意義，但CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移是牽涉到多步驟、多階段和多基因的復(fù)雜生物學(xué)過程，至今所涉及的分子機制尚未闡明。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1（metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1）是2009年被證實的一個與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因［4］，有望為CRC分子靶向治療提供新的策略［5］。目前國內(nèi)外針對MACC1在CRC中的相關(guān)研究均有報道，但MACC1在CRC發(fā)生、發(fā)展以及作為治療靶點的相關(guān)機制尚未完全闡明。本研究在組織學(xué)和細胞學(xué)水平層面，以有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為切入點，采用免疫組化和免疫細胞化學(xué)方法檢測CRC組織和不同轉(zhuǎn)移潛能的CRC細胞系中的MACC1表達，探討CRC中MACC1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為后續(xù)進一步研究MACC1在CRC侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用以及是否能作為治療靶點提供初步理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院病理科庫存的2015年3月至2017年12月手術(shù)切除的77例大腸癌及癌旁石蠟組織，均經(jīng)過4%中性緩沖甲醛固定及石蠟包埋。所有病例均有完整的臨床資料并且經(jīng)過病理診斷證實。結(jié)直腸癌的病理診斷根據(jù)WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類標準第四版，臨床分期參照美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第七版分期。所有病例術(shù)前未經(jīng)放化療。人結(jié)直腸癌細胞系SW480和SW620由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系提供。兔多克隆濃縮型抗體MACC1（產(chǎn)品編號ab106579）購自英國abcam公司。即用快捷型免疫組織化學(xué) MaxVisionTMHRP（Mouse/Rabbit）檢測試劑盒（產(chǎn)品編號KIT-5002）、PBS緩沖液、DAB顯色劑、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液和抗體稀釋液均購自福州邁新公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)檢測所有石蠟組織塊4 μm厚切片，防脫玻片撈片后于70℃烤箱烤片30 min，常規(guī)脫蠟至水后玻片放入高壓鍋內(nèi)，加入足量檸檬酸鹽修復(fù)液至完全浸沒玻片，電磁爐加熱沸騰高壓修復(fù)3 min，自然冷卻后PBS漂洗5次，每3 min一次，玻片浸泡在醫(yī)用雙氧水中10 min，PBS漂洗5次，每3 min一次；加入抗MACC1一抗（稀釋度1∶1 500），37℃孵育1 h，PBS漂洗5次，每3 min一次，加入二抗，37℃孵育20 min，PBS漂洗5次，每3 min一次；DAB顯色，顯微鏡下控色，自來水終止DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，70℃烤片30 min至完全烤干水分后中性樹脂封固。以人肝組織為陽性對照，PBS取代一抗作陰性對照。

1.2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果判定MACC1陽性顯色主要定位于細胞漿，少數(shù)可同時定位于細胞核。陽性顯色為細胞中的相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃至棕褐色顆粒著色。染色結(jié)果判定參照文獻［6］，由高年資病理醫(yī)師在雙盲情況下對切片染色結(jié)果進行判讀：按染色強度計分，無色計0分，淡黃色、棕黃色和棕褐色依次1、2、3分；再將陽性細胞數(shù)所占百分比打分：陰性判為0分，陽性細胞數(shù)百分比在≤10%、11%～50%、51%～75%和＞75%分別計1分、2分、3分和4分，染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3分判為免疫組化結(jié)果陽性。

1.2.3免疫細胞化學(xué)染色SW480和SW620細胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。取6個不同培養(yǎng)批次的生長狀態(tài)良好的細胞，胰酶消化后低速離心收集，制作石蠟包埋細胞塊，細胞塊制作方法按照文獻［7］。石蠟細胞塊4 μm厚切片，免疫細胞化學(xué)檢測檢測操作方法同上述免疫組織化學(xué)檢測。以棕黃色為陽性信號，按照染色深淺，分為弱陽性（1+），中等陽性（2+），強陽性（3+）。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料組間率的比較采用Pearson Chi-Square Test，結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素分析采用二分類的Logistic回歸分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MACC1在CRC組織中的表達MACC1蛋白陽性表達于CRC組織的細胞漿，部分癌細胞的細胞核也有表達，癌組織周圍的纖維間質(zhì)也可見陽性表達（圖1），MACC1蛋白在CRC組織的陽性表達率76.62%（59/77）。MACC1蛋白在癌旁正常黏膜組織中大部分呈陰性表達，陽性表達率11.69%（9/77）。統(tǒng)計顯示MACC1在CRC組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常黏膜（χ2=65.83，P=0.00）。

圖1 免疫組化檢測MACC1在結(jié)直腸癌中的表達（MaxVisionTM×200）Fig.1 Immunohistochemical detection of MACC1 expression in colorectal carcinnoma

2.2MACC1與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的單因素分析經(jīng)單因素分析可知，腫瘤分化程度、腫瘤大小、浸潤深度、MACC1陽性表達、神經(jīng)侵犯和臨床分期可能是CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素（均P＜0.05），年齡、性別不是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素（均P＞0.05）。見表1。

2.3影響結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素Logistic回歸分析對可能是影響結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的6個高危因素進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示MACC1異常高表達、神經(jīng)侵犯、浸潤深度和臨床分期是結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素（均P＜ 0.05），見表2。

表1 結(jié)直腸癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的單因素分析Tab.1 The univriate analysis of lymph node metastasis in colorectal carcinoma例

表2 影響結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素Logistic回歸分析Tab.2 The multivariate binary logistic regression analysis of lymph node metastasis in colorectal carcinoma

2.4不同轉(zhuǎn)移潛能CRC細胞中MACC1表達情況MACC1蛋白在SW480細胞中呈弱或中等陽性表達（1+或2+），在SW620細胞呈中等陽性或強陽性表達（2+或3+）（圖2）。統(tǒng)計分析顯示，MACC1蛋白在SW620細胞中的表達明顯強于SW480細胞（χ2=20.11，P=0.00，表3）。

圖2 免疫細胞化學(xué)檢測MACC1在SW480（A）和SW620（B）細胞中的表達（MaxVisionTM×200）Fig.2 Immunocytochemical detection of MACC1 expression in SW480（A）and SW620（B）cells

表3 MACC1在SW480和SW620細胞中的表達比較Tab.3 Comparision of MACC1 expression in SW480 and SW620 cells例

3 討論

CRC的多學(xué)科綜合治療已迅速發(fā)展，但中晚期CRC的臨床治療效果有限，5年生存率仍然不高。國內(nèi)外眾多研究表明，侵襲和轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的因素。因此，針對CRC侵襲和轉(zhuǎn)移的策略成為研究的熱點。MACC1蛋白定位于人類的7號常染色體上（7P21.1），具有廣泛的生物學(xué)功能，特別是在調(diào)控惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面具有不可代替的重要功能［8］。已證實MACCl編碼的蛋白質(zhì)能通過調(diào)節(jié)激活肝細胞生長因子/肝細胞生長因子受體（HGF/c-Met）通路中的c-Met基因，上調(diào)c-Met蛋白的表達，促進腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［9］。MACCl在多種惡性腫瘤如結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌等組織中表達異常增高，與腫瘤臨床分期、有無遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有作為腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷的潛在獨立指標，有望為惡性腫瘤的基因治療提供新靶點［10-11］。

本研究結(jié)果顯示MACC1在CRC組織的陽性表達率顯著高于癌旁正常黏膜，與文獻報道的基本一致［11-12］。根據(jù)AJCC指南，發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC患者至少屬于Ⅲ期［13］，所以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是CRC晚期患者的重要條件。為了更好評價MACC1在CRC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，本研究以有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為切入點，采用單因素分析可能與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度、腫瘤大小、浸潤深度、MACC1陽性表達、神經(jīng)侵犯和臨床分期等都可能是CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素。一般來說，腫瘤體積越大、瘤組織分化越差、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯和臨床分期越晚，都與CRC不良預(yù)后密切相關(guān)，代表腫瘤細胞具有更強的侵襲力和轉(zhuǎn)移特性［14］。本研究分析出來的與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能的高危因素基本上與文獻報道符合［15］。

STEIN等［4］報道MACC1可以作為預(yù)測結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的獨立指標。本研究對可能是影響CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的6個高危因素進行Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)MACC1異常高表達、神經(jīng)侵犯、浸潤深度和臨床分期是結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，在組織學(xué)水平證實了MACC1是CRC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。在細胞水平，本研究發(fā)現(xiàn)MACC1在高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的SW620細胞中高表達，在低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的SW480細胞中低表達。SW620和SW480細胞系是從同一個大腸癌患者復(fù)發(fā)淋巴結(jié)病灶和原發(fā)病灶原代培養(yǎng)獲得，兩者具有一致的遺傳學(xué)背景，因此為研究CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)機制提供了一個合適的模型［16］。本研究這些結(jié)果綜合提示MACC1蛋白高表達是CRC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，與CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)。

綜上所述，MACC1在CRC組織中表達明顯增高，是CRC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，提示MACC1在CRC中的表達增強，促使癌細胞具有更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，參與了結(jié)直腸癌的惡性進展，但本研究只是初步從組織及細胞水平探討了MACC1與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，具體機制仍然有待后續(xù)研究深入探討CRC中以MACC1為核心的上下游侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)控機制，特別是與miRNA的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，以望為闡明CRC侵襲、轉(zhuǎn)移機制及靶向基因治療提供新的基礎(chǔ)及策略。