硫酸右旋糖酐抑制人胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用

高文衛(wèi) 金秀 田潤(rùn)玲 黃允寧 徐遠(yuǎn)義

1寧夏醫(yī)科大學(xué)（銀川 750001）；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（山東濟(jì)寧 272029）；3寧夏寧安醫(yī)院（銀川750041）；4寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院（銀川 750021）

胃癌的發(fā)病率和死亡率居于全世界的消化道腫瘤前列，并且呈年輕化趨勢(shì)［1-2］?；熕幬镏委煶蔀槲赴└骨粌?nèi)種植轉(zhuǎn)移的主要治療手段，但到目前療效并不顯著。所以，目前亟待尋找新的有效治療胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移的抗癌藥物，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。

硫酸右旋糖酐（dextran sulfate，DS）是大分子右旋糖酐，分子量500 000。國(guó)外從1997年開始研究DS的抗癌作用，研究表明DS在腹腔內(nèi)不易被吸收，且作用時(shí)間長(zhǎng)，被認(rèn)為是具有潛力的抗癌藥物［3］，但其具體機(jī)制尚不清楚。

LOX（銅-依賴性胺氧化酶）在低氧誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境中扮演著啟動(dòng)開關(guān)的重要作用［4-5］。上調(diào)LOX表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［6］。

因此，本研究將通過人胃癌細(xì)胞AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的體外培養(yǎng)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)DS對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移變化及DS對(duì)人胃癌細(xì)胞（BGC-823）LOX表達(dá)的影響。旨在明確DS對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中增殖、侵襲、遷移的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1人胃癌細(xì)胞株本研究所用的人低分化胃腺癌細(xì)胞株（BGC-823）購(gòu)自于北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。高分化胃腺癌細(xì)胞株AGS、未分化胃腺癌細(xì)胞株MGC-803，中分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901及正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，均受贈(zèng)于上海華東師范大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥品DS分子量約500 000，購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)將5種細(xì)胞培養(yǎng)于無菌恒溫培養(yǎng)箱37℃、5%CO2的完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，傳代于60 mm培養(yǎng)皿中，于對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別加入PBS及DS（終濃度為0.3%），不同時(shí)間后，收集細(xì)胞備檢，將部分BGC-823細(xì)胞放置于低氧培養(yǎng)箱，37 ℃，5%CO2，1%O2，培養(yǎng)不同時(shí)間后，收集細(xì)胞備檢。

1.4CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖調(diào)整細(xì)胞懸液密度為2.5×104個(gè)/mL，以 200 μL/孔 接種于 96 孔板，將6個(gè)96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，換液，實(shí)驗(yàn)組加入含0.3%DS的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含等量PBS的培養(yǎng)液。0、6、12、24、36、48 h 后，每個(gè)孔內(nèi)加入10 μL CCK8液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，每組取5個(gè)復(fù)孔平均值。

1.5Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)上室提前鋪Matrigel膠，待凝膠凝固后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，取細(xì)胞懸液200 μL加入上室，在24孔板下室，實(shí)驗(yàn)組加入500 μL含F(xiàn)BS和3%DS的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含F(xiàn)BS和PBS的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h。吸走上室內(nèi)的舊培養(yǎng)液，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，將侵襲穿過膜的細(xì)胞進(jìn)行固定和結(jié)晶紫染色，取5～10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

1.6Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL。取細(xì)胞懸液200 μL加入上室，24孔板下室，實(shí)驗(yàn)組加入500 μL含F(xiàn)BS和3%DS的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含F(xiàn)BS和PBS的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h。吸走上室內(nèi)的舊培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，將遷移過膜的細(xì)胞進(jìn)行固定和結(jié)晶紫染色，取5～10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

1.7細(xì)胞免疫化學(xué)染色將細(xì)胞爬片4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，Triton 20 min，雙氧水15 min，封閉血清20 min，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封固。LOX于細(xì)胞核表達(dá)，觀察陽(yáng)性細(xì)胞分布特點(diǎn)及變化。應(yīng)用IPP圖像自動(dòng)分析系統(tǒng)，在400倍鏡下，選定空白區(qū)定標(biāo)，選定具有代表性的5個(gè)視野，測(cè)定光密度值，并進(jìn)行計(jì)算，以獲得所選視野的平均光密度值（optical density，OD）。

1.8Western-blot檢測(cè)LOX蛋白的表達(dá)將BGC823細(xì)胞培養(yǎng)至不同時(shí)間點(diǎn)，冰PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液，刮下皿底細(xì)胞，在冰上充分裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心機(jī)離心15 min，取上清。用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。等量蛋白（50～200 μg）上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（8%～10%），濕轉(zhuǎn)電泳轉(zhuǎn)移蛋白于硝酸纖維素膜上。10%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，相應(yīng)抗體4度孵育過夜。二抗孵育室溫1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色1 min，Amersham Imager 600儀器曝光。并使用Quantity one進(jìn)行半定量檢測(cè)，目的/內(nèi)參表示相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 CCK8檢測(cè)DS對(duì)5種細(xì)胞的增殖影響5種細(xì)胞共檢測(cè)了6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，0、6、12、24、36、48 h，結(jié)果顯示，AGS細(xì)胞在24 h（P＜ 0.05，21.1%），36 h（P＜0.01，15.4%），48 h（P＜0.05，7.5%）實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞明顯比對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SGC-7901細(xì)胞，直到 36 h（P＜ 0.05，20%），48 h（P＜0.05，19.5%）出現(xiàn)了DS抑制細(xì)胞增殖的顯著差異；BGC-823細(xì)胞，在36 h，DS明顯減小了細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05，18.8%）；MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在0、6、12、24、36、48 h差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1 5種細(xì)胞CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖的統(tǒng)計(jì)折線圖Fig.1 CCK-8 assays to detect five kinds of cells proliferation

2.2Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS對(duì)5種細(xì)胞侵襲力的影響在Matrigel膠上接種5種細(xì)胞24 h后，胃癌細(xì)胞株BGC-823（P＜ 0.01）、MGC-803（P＜0.01）、SGC-7901（P＜ 0.01）的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯比GES-1多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而胃癌細(xì)胞株AGS與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的穿膜細(xì)胞數(shù)均比較少，兩者無明顯差別，對(duì)照組平均穿膜細(xì)胞數(shù)最多的胃癌細(xì)胞是MGC-803，然后依次是BGC-823、SGC-7901、AGS；相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組DS明顯減少了5種細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且對(duì)BGC-823細(xì)胞（抑制率95%，P＜0.01）的侵襲抑制作用最明顯，其次是AGS（92.8%，P＜ 0.01）、MGC-803（90.1%，P＜ 0.01）、SGC-7901（87.8%，P＜ 0.01）、GES-1（72.3%，P＜ 0.01）（圖2）。

圖2 Tranwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)Fig.2 Tranwell cell invasion and migration assays detect invasion and transfer ability of these cells

2.3Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS對(duì)5種細(xì)胞遷移力的影響在Transwell膜上生長(zhǎng)24 h后，胃癌細(xì)胞株AGS（P＜ 0.05）、BGC-823（P＜ 0.05）、MGC-803（P＜ 0.01）、SGC-7901（P＜ 0.01）的穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯比GES-1多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)照組平均穿膜細(xì)胞數(shù)最多的胃癌細(xì)胞是MGC-803，然后依次是BGC-823、SGC-7901、AGS；相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組DS明顯減少了5種細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且對(duì)AGS細(xì)胞（抑制率96%，P＜0.01）的遷移抑制作用最明顯，其次是SGC-7901（94.1%，P＜ 0.01）、MGC-803（91.2%，P＜ 0.01）、BGC-823（90.5%，P＜ 0.01）、GES-1（84.3%，P＜0.01）（圖2）。

2.4免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)LOX的表達(dá)隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組LOX表達(dá)量呈增加的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組DS能夠顯著降低LOX的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，結(jié)果差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2 h（P＞ 0.05），8 h（P＜ 0.05），12 h（P＜ 0.01），24 h（P＜ 0.01）（圖3）。

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)觀察BGC-823細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)LOX的表達(dá)變化Fig.3 Immunocytochemistry detection of LOX expression at different time points

2.5Western blotting檢測(cè)LOX的蛋白表達(dá)在低氧條件下，對(duì)照組中LOX蛋白表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，而DS能夠顯著降低LOX表達(dá)量。與對(duì)照組相比，結(jié)果顯示部分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（8、12、24 h，P＜ 0.05；2 hP＞ 0.05）（圖4）。

圖4 Western blotting檢測(cè)LOX的蛋白表達(dá)Fig.4 Western blotting detecting LOX protein expression

3 討論

胃癌發(fā)生發(fā)展過程中極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，并且分化程度不同的瘤細(xì)胞可能有不同的增殖和侵襲遷移能力，因此如何防治和治療胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是目前亟需解決的問題。

不同分化程度的瘤細(xì)胞可能有著不同的增殖能力。有體外研究表明DS可抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞黏附性、細(xì)胞周期進(jìn)展和基因表達(dá)［7］。本研究采用不同分化程度的人胃癌細(xì)胞株AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)DS對(duì)其增殖的影響。本研究通過CCK8增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，在6、12 h DS對(duì)5種細(xì)胞的增殖均無明顯抑制作用；在24 h檢測(cè)出DS抑制AGS 21.1%；在36 h DS減少AGS 15.4%，SGC-7901 20%和BGC-823 18.8%，在48 h DS抑制AGS 7.5%和SGC-7901 19.5%，48 h內(nèi)DS對(duì)MGC-803一直無明顯抑制作用，表明DS對(duì)高分化胃癌細(xì)胞AGS的增殖抑制作用最早，且最強(qiáng)，而DS對(duì)未分化胃癌細(xì)胞MGC-803無明顯增殖抑制作用。推測(cè)DS對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用可能與分化程度有關(guān)。

分化程度不同的瘤細(xì)胞具有不同的遷移能力。有研究證明，胃癌細(xì)胞BGC-823侵襲能力明顯強(qiáng)于胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901及人胚胃上皮細(xì)胞 GES-1［8］。本研究 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯比GES-1多，可見這4種胃癌細(xì)胞的遷移能力都比正常胃黏膜細(xì)胞強(qiáng)。胃癌細(xì)胞中平均穿膜細(xì)胞數(shù)最多的是未分化胃癌細(xì)胞MGC-803，然后依次是低分化胃癌細(xì)胞BGC-823、中分化胃癌細(xì)胞SGC-7901、高分化胃癌細(xì)胞AGS，可見分化程度越低，穿膜細(xì)胞數(shù)越多，細(xì)胞遷移力越強(qiáng)；與對(duì)照組相比，DS明顯減少了實(shí)驗(yàn)組5種細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)，且對(duì)高分化胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞的遷移抑制作用最明顯，其次是SGC-7901、MGC-803、BGC-823和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1。由此推測(cè)，DS可能對(duì)5種細(xì)胞株的遷移能力均有抑制作用，并且與分化程度有關(guān)。

不同分化程度的瘤細(xì)胞具有不同的侵襲能力。本研究侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞中平均穿膜細(xì)胞數(shù)最多的是MGC-803，然后依次是BGC-823、SGC-7901和AGS，可見分化程度越低穿膜細(xì)胞數(shù)越多，可能是因?yàn)榧?xì)胞分化程度越低，其侵襲力越強(qiáng)，降解細(xì)胞外基質(zhì)穿過基質(zhì)膠的能力越強(qiáng)；相比對(duì)照組，DS明顯減少了實(shí)驗(yàn)組5種細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)，且對(duì)BGC-823細(xì)胞的侵襲抑制作用最明顯，其次是 AGS、MGC-803、SGC-7901、GES-1。本研究表明，DS對(duì)5種細(xì)胞侵襲過程的抑制強(qiáng)度順序與抑制遷移的順序不同，也與細(xì)胞分化程度無明顯關(guān)系。有研究表明［9］，腫瘤細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶是降解基底膜和間質(zhì)的主要成分，還有一種非蛋白酶依賴性的變形運(yùn)動(dòng)和膜泡運(yùn)動(dòng)的轉(zhuǎn)移方式。DS對(duì)5種細(xì)胞的侵襲和遷移的抑制強(qiáng)度順序不同，可能是因?yàn)槿毖醐h(huán)境下幾種細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶、降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力不同，并且DS可能對(duì)幾種細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶有不同程度的抑制作用，具體抑制程度尚需要進(jìn)一步研究。

課題組前期曾研究表明DS可以調(diào)節(jié)人胃癌細(xì)胞BGC-823 HIF-1α的蛋白表達(dá)，其可能會(huì)通過下調(diào)HIF-1α的表達(dá)從而抑制人胃癌細(xì)胞大網(wǎng)膜種植轉(zhuǎn)移［10］。而LOX被認(rèn)為是受HIF調(diào)控的，是HIF-1的直接靶點(diǎn)之一，其在遷移和黏附的功能上需要缺氧誘導(dǎo)而發(fā)生［11］。LOX在低氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移過程中主要作用表現(xiàn)在細(xì)胞定位、細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)化狀態(tài)，在腫瘤微環(huán)境中扮演著啟動(dòng)開關(guān)轉(zhuǎn)移的重要作用［12］。研究證明，LOX活性是由氧含量進(jìn)行調(diào)節(jié)的，并且LOX能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和黏附能力［13］。于是本研究進(jìn)行了DS對(duì)胃癌細(xì)胞中LOX表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)在低氧條件下表明，對(duì)照組LOX蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)升高，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用DS后能顯著降低LOX表達(dá)水平，表明DS可能通過影響LOX表達(dá)抑制人胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，但其機(jī)制可能與HIF-1α有關(guān)系，還需進(jìn)一步研究。