前增菌時(shí)間對(duì)生禽肉中沙門(mén)菌檢驗(yàn)的影響研究

◎ 朱應(yīng)飛，曾春華，吳 鑫，翟平平，范宏偉，姚小英

（1.江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西 南昌 330000；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330000)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

鼠傷寒沙門(mén)菌（ATCC14028），購(gòu)自廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要儀器

42 ℃恒溫培養(yǎng)箱，36 ℃恒溫培養(yǎng)箱，拍擊式均質(zhì)器，電子天平。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水（BPW）培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）培養(yǎng)基、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂（BS）培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基，購(gòu)自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；56種沙門(mén)菌診斷血清，購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沙門(mén)菌計(jì)數(shù)

鼠傷寒沙門(mén)菌（ATCC14028）純培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)采用傾注PCA平板計(jì)數(shù)。用0.85%的生理鹽水將增菌液稀釋成10-6、10-7、10-83個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2塊平皿，每塊平皿加1 mL稀釋液，傾注約20 mL溫度為48 ℃的PCA瓊脂，凝固后倒置36 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

前文詳細(xì)分析了換流器在發(fā)生不對(duì)稱(chēng)故障時(shí)計(jì)及兩側(cè)諧波的實(shí)際觸發(fā)角和換相角計(jì)算原理，進(jìn)而得到實(shí)際的熄弧角：

1.2.2 樣品采集

樣品采集時(shí)間為7月，分兩次進(jìn)行，每次采集10份，樣品來(lái)自于各商場(chǎng)，每個(gè)商場(chǎng)每次采一份樣，均為生禽肉，采樣量約300 g，樣品采集后用冰袋冷藏運(yùn)輸，3 h內(nèi)開(kāi)始檢驗(yàn)。

1.2.3 前增菌和增菌

無(wú)菌取25 g樣品分別加入到裝有225 mL BPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min。同時(shí)隨機(jī)取一份樣品加入10-7的沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)株稀釋液770 μL，均質(zhì)混勻作陽(yáng)性對(duì)照。將樣品混合物于36 ℃恒溫培養(yǎng)，8 h后，搖勻，移取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL TTB內(nèi)，于42 ℃增菌培養(yǎng)24 h。同時(shí)移取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，于36 ℃增菌培養(yǎng)24 h。8 h的前增菌液取樣后立刻放回培養(yǎng)箱繼續(xù)前增菌培養(yǎng)，前增菌18 h后，再搖勻，分別再取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL TTB和SC中，分別于42 ℃和36 ℃增菌培養(yǎng)24 h。

1.2.4 分離和鑒定

增菌24 h后，各管TTB和SC分別搖勻，用不銹鋼接種環(huán)劃線各接種一個(gè)BS平板和一個(gè)沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基平板，36 ℃培養(yǎng)。BS平板培養(yǎng)48 h，沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基平板培養(yǎng)24 h。從BS平板上挑取黑色或棕褐色或灰色且菌落周?chē)屎谏蜃厣目梢删洌瑥纳抽T(mén)菌顯色培養(yǎng)基平板上挑取淡紫色可疑菌落，分別接種三糖鐵（TSI）、賴(lài)氨酸脫羧酶、尿素、氰化鉀、靛基質(zhì)、甘露醇、山梨醇和ONPG。對(duì)生化反應(yīng)陽(yáng)性的可疑菌，從TSI轉(zhuǎn)種營(yíng)養(yǎng)瓊脂，做菌體抗原（O）鑒定和鞭毛抗原（H）鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門(mén)菌計(jì)數(shù)結(jié)果

沙門(mén)菌純培養(yǎng)稀釋到10-6、10-7、10-8后，計(jì)數(shù)結(jié)果分別為141 CFU/mL、13 CFU/mL、2 CFU/mL。

2.2 沙門(mén)菌的樣品檢驗(yàn)結(jié)果

20份生禽肉樣品的沙門(mén)菌定性檢驗(yàn)情況見(jiàn)表1。20份生禽肉中，總共檢出13份陽(yáng)性，通過(guò)8 h前增菌檢出8份，通過(guò)18 h前增菌檢出9份，兩個(gè)前增菌時(shí)間同時(shí)檢出的有4份。

在分離平板上，雞肫67和雞丁76沙門(mén)菌呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。雞丁64、雞丁66和鴨肫80可疑平板上只有1～2個(gè)可疑菌落生長(zhǎng)。雞丁68、雞丁70、雞肫71、雞丁72、雞丁74和鴨肫77可疑平板上有3～5個(gè)可疑菌落生長(zhǎng)。雞肫69和雞丁78可疑平板上有6個(gè)及以上可疑菌落生長(zhǎng)。分離平板上均有60～120個(gè)不等的單菌落生長(zhǎng)。

表1 生禽肉中沙門(mén)菌檢驗(yàn)結(jié)果表

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)和國(guó)際上沙門(mén)菌的檢驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法[2-3]依舊是以White-Kauffmann抗原表為基礎(chǔ)，依靠傳統(tǒng)的前增菌、增菌、分離、生化鑒定和血清鑒定。由于增菌分離的培養(yǎng)基種類(lèi)和質(zhì)量的差異，樣品基質(zhì)復(fù)雜，尤其是樣品中雜菌菌相復(fù)雜，影響了目標(biāo)菌的檢出，傳統(tǒng)沙門(mén)菌檢驗(yàn)面臨的最大技術(shù)問(wèn)題是假陰性。如何提高樣品的陽(yáng)性檢出率顯得尤為重要。

通過(guò)文獻(xiàn)檢索和多年對(duì)食品中沙門(mén)菌污染情況的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)生禽肉和生畜肉中沙門(mén)菌的污染最為嚴(yán)重，相應(yīng)的雜菌菌相復(fù)雜，生長(zhǎng)旺盛，嚴(yán)重干擾了沙門(mén)菌的檢驗(yàn)，極易造成假陰性，本研究選取生禽肉模擬雜菌菌相最為復(fù)雜、干擾最為嚴(yán)重的環(huán)境進(jìn)行研究。雞丁68號(hào)樣品加入陽(yáng)性對(duì)照菌，為保證能夠取到菌而又盡量少的加入，本試驗(yàn)加入10-7標(biāo)準(zhǔn)株稀釋液770 μL，約等于10 CFU鼠傷寒沙門(mén)菌量。

本研究共檢測(cè)了20份樣品，8 h前增菌和18 h前增菌的檢出率分別為40%和45%，顯著高于我國(guó)餐飲食品中沙門(mén)菌的檢出率9.7%[4]，顯著高于合肥市屠宰生豬肉沙門(mén)菌的檢出率13%[5]，顯著高于美國(guó)食品安全檢驗(yàn)署公布的2012年生畜肉及生禽肉產(chǎn)品中沙門(mén)菌檢出率（雞肉4.3%、豬肉1.3%、牛肉0.0%、嫩牛肉1.1%、絞牛肉1.9%、雞絞肉28%、火雞絞肉11%和火雞肉2.2%）[6]，可見(jiàn)南昌市生禽肉的沙門(mén)菌污染非常嚴(yán)重。本研究共檢出13份陽(yáng)性，綜合檢出率為65%。張玲等[7]用美國(guó)農(nóng)業(yè)部的方法對(duì)長(zhǎng)春市的市售雞胴體進(jìn)行沙門(mén)菌監(jiān)測(cè)，7月份檢出率為100%，與之相較明顯偏低，提示按現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，即使采用兩個(gè)前增菌時(shí)間，依然存在漏檢的可能。

本試驗(yàn)中，有5份樣品在前增菌8 h未檢出，前增菌18 h后有檢出，表明在某些樣品中，前增菌8 h并不能夠充分復(fù)蘇和增殖目標(biāo)菌，過(guò)短的前增菌階段容易造成目標(biāo)沙門(mén)菌的丟失。另有4份樣品在前增菌8 h有檢出，前增菌18 h后未檢出。前增菌18 h后，理論上沙門(mén)菌能得以更充分復(fù)蘇和增殖，造成沙門(mén)菌反而丟失的原因是前增菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使伴隨沙門(mén)菌的非目標(biāo)雜菌過(guò)度生長(zhǎng)，競(jìng)爭(zhēng)抑制甚至完全掩蓋了沙門(mén)菌的增殖。陽(yáng)性對(duì)照菌鼠傷寒沙門(mén)菌在8 h前增菌有檢出，18 h前增菌后未有檢出，也是同樣的道理。

13份陽(yáng)性樣品中，有兩份樣品，其分離平板上只有1～2個(gè)可疑菌落。在增菌液中目標(biāo)菌豐度低的情況下，從11 mL的增菌液中挑取5～20 μL進(jìn)行劃線，分離出1～2個(gè)可疑菌落這個(gè)過(guò)程本身具有很大的偶然性。這提示本試驗(yàn)檢定的7份陰性樣品中，有部分樣品很可能存在沙門(mén)菌，由于前増菌和增菌時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，造成目標(biāo)菌豐度低，接種環(huán)蘸取菌液時(shí)沒(méi)能蘸取到目標(biāo)菌，或者蘸取到少量的目標(biāo)菌，但由于與能夠在分離平板上良好生長(zhǎng)的非目標(biāo)雜菌比例過(guò)于懸殊，沒(méi)能分離到目標(biāo)菌，實(shí)際上是假陰性。

分離平板的選擇效果是有限的，對(duì)于增菌液中目標(biāo)菌豐度低的樣品，劃線分離平板上單個(gè)菌落的數(shù)量成了試驗(yàn)是否成功的另一關(guān)鍵，平板上的單個(gè)菌落越多，檢出目標(biāo)菌的可能性就越大，因此，在做分區(qū)劃線分離時(shí)，應(yīng)該盡量多地挑取菌液，第一區(qū)面積應(yīng)該盡量小，其他區(qū)域劃線在能夠分開(kāi)的前提下，盡量密，不留空白，這樣才能最大限度地劃出盡量多的單個(gè)菌落，最大可能地分離出目標(biāo)菌。

有2份陽(yáng)性樣品，其目標(biāo)菌在分離平板上呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，其他11份陽(yáng)性樣品中沙門(mén)菌的生長(zhǎng)遠(yuǎn)不如雜菌生長(zhǎng)旺盛，前增菌液培養(yǎng)基中沒(méi)有加入任何抑菌成分，是雜菌生長(zhǎng)最快的階段，需要在前增菌時(shí)間上做出適當(dāng)優(yōu)化，選擇一個(gè)最佳時(shí)間，在沙門(mén)菌充分復(fù)蘇，增殖數(shù)量與雜菌增殖數(shù)量之比最大時(shí)完成前增菌，效果最佳。

4 結(jié)論

由于無(wú)法事先準(zhǔn)確預(yù)知樣品中雜菌污染情況，因此無(wú)法確定最佳前增菌時(shí)間，同時(shí)采用兩個(gè)前增菌時(shí)間，可以大幅度提高檢出目標(biāo)菌的機(jī)會(huì)，同時(shí)，劃線分離的平板數(shù)量加倍，劃線分離的單個(gè)菌落數(shù)也會(huì)相應(yīng)的增加，對(duì)于豐度低的沙門(mén)菌樣品，可以大大提高其檢出率。樣品中目標(biāo)菌可能會(huì)出現(xiàn)前增菌8 h不夠充分復(fù)蘇和增殖，而前增菌18 h造成雜菌過(guò)度生長(zhǎng)。建議采用3個(gè)前增菌時(shí)間8 h、13 h、18 h。這樣，在不至于增加太多的工作量的情況下，可以最大限度的提高目標(biāo)菌檢出率。樣品在前增菌8 h時(shí)，甚至在前增菌之初，雜菌已經(jīng)過(guò)度生長(zhǎng)，目標(biāo)菌在前增菌的開(kāi)始階段就被競(jìng)爭(zhēng)抑制，按照現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法檢測(cè)到目標(biāo)菌，這就要求更好的選擇性增菌效果和更高效的分離培養(yǎng)基，如何對(duì)增菌和劃線分離進(jìn)行優(yōu)化，還有待進(jìn)一步研究。