不同花色紫斑牡丹的CDDP體系優(yōu)化及其遺傳多樣性分析

陳 燕，李婉茹，唐 紅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，蘭州 730000)

牡丹原產(chǎn)于中國，素有國色天香的美譽，古有“自李唐來，世人甚愛牡丹”之說。目前中國的栽培牡丹劃分為中原、西北、江南和西南四大品種群，其中西北牡丹即紫斑牡丹是僅次于中原牡丹品種群的第二大品種群[1]。紫斑牡丹因花基部有一塊明顯的紫斑而得名。在長期的自然選擇及人工栽培下，紫斑牡丹的遺傳變異類型更加豐富。但是，紫斑牡丹種源復(fù)雜，不同地區(qū)各自命名，因此同名異物、同物異名的情況很普遍，這就給紫斑牡丹的品種鑒定和育種工作帶來了諸多困難。開發(fā)簡單快捷、信息量豐富、鑒別能力強的分子標(biāo)記技術(shù)對植物品種鑒定及選育是必要的[2]。自20世紀(jì)末以來，牡丹種質(zhì)資源DNA水平上的研究一直被國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，但多側(cè)重于探討牡丹組野生種間親緣關(guān)系、遺傳多樣性及起源和分類[3]，關(guān)于紫斑牡丹品種水平上的遺傳多樣性及品種鑒定研究相對較少[4-6]。裴顏龍等[7]最早用RAPD技術(shù)研究了矮牡丹和紫斑牡丹基因組DNA，發(fā)現(xiàn)，RAPD技術(shù)不僅可以檢測野生牡丹居群內(nèi)與居群間的遺傳變異，還具有研究種間進化和親緣關(guān)系的潛力；陳向明等[8]利用RAPD-PCR技術(shù)研究了不同花色牡丹品種的親緣關(guān)系；朱紅霞[9]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)初步建立了牡丹、芍藥部分品種的DNA指紋圖譜；王燕青[10]和王娟[11]等分別利用SRAP-PCR標(biāo)記研究了33個中原牡丹品種間的遺傳多樣性和20個牡丹品種基因組DNA多態(tài)性。然而，這些傳統(tǒng)意義上的隨機DNA分子標(biāo)記得到的位點通常與目標(biāo)性狀基因距離較遠(yuǎn)，品種間鑒別效率不高。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，新型標(biāo)記方法如CDDP、EST-EER、SNP等也逐漸運用在植物分子水平的研究[12-14]。

CDDP (conserved DNA-derived polymorphism)分子標(biāo)記技術(shù)是由Collard和Mackill于2009年在水稻研究中開發(fā)出來的基于DNA保守序列的新型分子標(biāo)記方法。它是一種目的基因標(biāo)記方法，能產(chǎn)生與目標(biāo)性狀連鎖的功能性分子標(biāo)記[15-16]。對水稻、菊花、大豆、玫瑰的研究表明，CDDP分子標(biāo)記方法具有操作簡單、成本低廉、多態(tài)性豐富等優(yōu)點[16-18]。該方法是對RAPD、AFLP、ISSR等傳統(tǒng)標(biāo)記方法的有效補充，更是對形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)鑒定方法的輔助，能從分子角度為植物品種間的遺傳多樣性分析及鑒定提供科學(xué)幫助。本研究利用CDDP分子標(biāo)記對47個不同花色紫斑牡丹品種的基因組DNA進行遺傳多樣性分析，為紫斑牡丹品種鑒定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年4月至6月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木遺傳分子實驗室完成。供試材料為47個紫斑牡丹栽培品種(表1)。根據(jù)成仿云等[1]提出的花色、花型分類標(biāo)準(zhǔn)，隨機選擇具有代表性的品種作為試驗材料。所有材料均采于甘肅省蘭州市榆中縣和平油用牡丹良種種苗繁育基地。于2018年4月采集紫斑牡丹莖稈頂端的嫩葉，每個品種采集嫩葉約1 g，將采集到的嫩葉表面灰塵等雜物擦去，用錫箔紙包裹好，置于液氮中存放，帶回實驗室之后立即取出并存放在-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)的DNA提取。

1.2 研究方法

1.2.1基因組DNA的提取與檢測采用天根公司的植物DNA提取試劑盒提取紫斑牡丹嫩葉的基因組DNA，采用超微量分光光度計檢測DNA濃度與質(zhì)量，并將部分DNA原液稀釋成濃度為15 ng/μL的母液，保存在-4 ℃冰箱備用，DNA原液存放在-20 ℃冰箱中。

1.2.2CDDP-PCR擴增體系優(yōu)化1)反應(yīng)體系優(yōu)化 試驗所用的21條引物均由上海生工生物有限公司合成，引物編號及序列信息見表2。所有引物稀釋成10 pmol/μL的母液，用20 μL離心管分裝后保存在-20 ℃冰箱備用。

CDDP-PCR反應(yīng)總體系為20 μL，其中2×Es Taq MasterMix(含染料)10 μL，采用正交試驗設(shè)計對引物濃度、DNA模板濃度進行2因素4水平優(yōu)化，選出適合紫斑牡丹的反應(yīng)體系。以“天女散花”為DNA模板，MYB1(Pr1)為引物，共16個處理(表3)。

反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃后延伸5min，最后4 ℃短期保存。

2)退火溫度篩選 根據(jù)候小改等提出的PCR復(fù)性溫度一般低于引物Tm值15 ℃到5 ℃，由PCR儀自動生成8個溫度梯度。以引物18為例，其Tm值為62.7 ℃，則在42.7～57.7 ℃的溫度范圍內(nèi)，PCR儀自動生成的溫度分別為47.7、48.1、49.4、51.2、53.6、55.6、56.9和57.7 ℃。用此法分別對21條引物進行最適退火溫度的篩選。

1.2.3電泳及檢測取6 μL擴增產(chǎn)物在溶有4 s gelred核酸染料2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，電壓5 V/cm，電泳2 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并采集圖像。

表1 供試紫斑牡丹品種信息

表2 用于紫斑牡丹品種遺傳關(guān)系分析的CDDP引物

表3 PCR正交試驗設(shè)計表

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計將每條CDDP引物擴增出來的每條帶視為一個位點，采用Gel-Pro analyzer條帶統(tǒng)計軟件結(jié)合人工識別的方法統(tǒng)計位點總數(shù)及多態(tài)性位點數(shù)，條帶清晰的記為1，缺失記為0。引物的位點多態(tài)信息量(polymorhism information content, PIC)按公式PIC=1-∑(Pi)2，其中Pi為第i種等位位點占總等位位點的比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫斑牡丹CDDP反應(yīng)體系優(yōu)化

根據(jù)表3正交試驗設(shè)計擴增結(jié)果(圖1)可以看出，擴增出的條帶清晰明亮，條帶數(shù)量多且整齊。當(dāng)DNA含量固定為15、30、45和60 ng時，隨著引物量的增加，擴增條帶數(shù)目也在增加，但當(dāng)引物含量超過15 pmol時，條帶數(shù)又開始減少，因此引物濃度不宜過高，最佳值為15 pmol。當(dāng)引物含量一定時，隨著DNA濃度的增加，擴增的條帶數(shù)也增加，且亮度提高。最后確定15號為最佳體系，即20 μL體系中，DNA模板量為60 ng，引物含量為15 pmol。最后確立紫斑牡丹CDDP反應(yīng)最佳體系為：PCR總反應(yīng)體系20 μL，其中包括2×EsTaqMasterMix酶(含染料)10 μL，1.0 pmol/μL引物1.5 μL，15 ng/μL DNA模板4 μL，ddH2O 4.5 μL。

2.2 引物的篩選

采用上述穩(wěn)定的紫斑牡丹CDDP反應(yīng)體系，以紫斑牡丹品種“醉妃”基因組為DNA模板，對21條引物進行多態(tài)性篩選。試驗結(jié)果顯示，除引物Pr17和Pr20沒有擴增出任何條帶，其余19條引物均能擴增出清晰可辨的條帶，每條引物擴增出的條帶數(shù)2～6條不等(圖2)。因此，除引物Pr17和引物Pr20外，其余19條引物均可用于紫斑牡丹品種的多態(tài)性分析。

2.3 引物退火溫度的篩選

引物的退火是影響PCR擴增結(jié)果的關(guān)鍵因素。退火溫度過低，擴增出的產(chǎn)量較高，但是很容易引起模板DNA與引物的錯配從而導(dǎo)致雜帶較多；退火溫度過高，DNA模板和引物結(jié)合差，條帶數(shù)目少，亮度低。理想狀態(tài)下，引物處于最佳退火溫度，才既可以保證引物同目的序列有效退火又可以減少非特異性的結(jié)合。本實驗以“醉妃”為DNA模板對所有引物的最適退火溫度進行篩選，擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖上電泳分離。以Pr18引物為例，其在47.4、48.1、49.4、51.2、53.6、55.6、56.9和57.7 ℃時都能擴增出清晰明亮的條帶，但在溫度為53.6 ℃時，擴增出的條帶無彌散拖尾現(xiàn)象，條帶最為清晰整齊(圖3)。確定該引物的最佳退火溫度為53.6 ℃。各引物最佳退火溫度見表2。

1～16對應(yīng)表3中的處理號； M.DL2000圖1 正交試驗下的擴增結(jié)果1-16 was correspond to those treatments listed in Table 3； M. DL2000 plusFig.1 The results of orthogonal design

1～21引物1～21；M. DL2000圖2 21條引物對紫斑牡丹品種‘醉妃’的擴增結(jié)果1-21 primer 1-21; M. DL2000Fig.2 The amplification of 21 CDDP primers to P. rockii cultivar ‘Zuifei’

圖3 引物MADS-4(Pr18)退火溫度篩選Fig.3 The annealing temperature screening of primer MADS-4(Pr18)

2.4 CDDP分子標(biāo)記鑒定紫斑牡丹品種的遺傳多態(tài)性分析

從表4可看出，篩選出來的19條適用于紫斑牡丹引物一共擴增出112條帶，其中多態(tài)性條帶97條，多態(tài)性比率為 86.61%。PIC是衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量的指標(biāo)：當(dāng)PIC> 0.5時，則表示該位點呈高度多態(tài)性；當(dāng)0.25

由UPGMA聚類分析(圖4)可知，47份紫斑牡丹的遺傳相似系數(shù)變化范圍是0.72～0.95，平均遺傳相似系數(shù)為0.835，顯示供試樣品遺傳多樣性高。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.72時，所有供試材料聚為兩類，第Ⅰ類由45個供試樣品組成，第Ⅱ類由2個黃色品種：“海黃”和“華夏金龍”組成。從觀賞性狀上看，相同花色的品種大體上聚為一類，但也并非完全聚在一起。

表4 CDDP引物擴增結(jié)果

材料編號同表1圖4 47份紫斑牡丹材料的UPGMA聚類分析圖Material number is shown in Table 1Fig.4 Dendrogram obtained from 47 P. rockii genotypes based on UPGMA analysis generated by SM

1～24對應(yīng)表1中材料編號；M.DL2000圖5 5號引物的樣品擴增圖1-24 was correspond to sample numbers listed in Table 1; M.DL2000Fig.5 The amplification of Pr5 primer to individual of P. rockii

2.5 紫斑牡丹品種鑒定

任意2個品種在同一引物下產(chǎn)生的帶型不同則表明該引物可以區(qū)分這2個品種。本研究中CDDP引物ERF3(Pr11)可區(qū)分的樣本數(shù)最多(13個)，引物ERF2(Pr10)可區(qū)分的樣本數(shù)最少為0。由表4知，CDDP引物對紫斑牡丹的鑒別力在0～13之間，其中鑒別力超過10 的有3條引物，分別是WRKY-R2(Pr5)、ERF3(Pr11)和MADS-4(Pr18)。

根據(jù)表4條帶分析結(jié)果，19條引物共產(chǎn)生了30條特異性條帶，除引物Pr1、Pr2、Pr10、Pr11、Pr15及Pr18沒有產(chǎn)生特異性條帶，其余13條引物均產(chǎn)生了1～5條特異性條帶。特異性條帶即只有某一品種具有或者某一品種缺失的條帶，它能夠便捷地將該品種與其他品種區(qū)分開來，為紫斑牡丹品種間的鑒別提供了研究方向。部分?jǐn)U增結(jié)果見圖5。

3 討 論

3.1 利用CDDP分子標(biāo)記技術(shù)分析紫斑牡丹遺傳多樣性

遺傳多樣性可能是對進化的適應(yīng)，它是物種適應(yīng)不斷變化的環(huán)境的一個重要反應(yīng)[19]。通常情況下，一個物種的遺傳多樣性越豐富，其對環(huán)境的適應(yīng)能力也就越強。普遍認(rèn)為稀有的或者分布區(qū)狹窄的物種遺傳多樣性水平偏低[20]。然而，近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，一些特有的和瀕危的物種仍然保持著較高的遺傳變異[5]。本研究采用的CDDP分子標(biāo)記方法，得出供試的47份紫斑牡丹的多態(tài)性比例達86.61%，這一結(jié)果高于楊美玲等[5]用ISSR標(biāo)記方法在16份紫斑牡丹研究出的71.6%和裴顏龍等[7]利用RAPD標(biāo)記方法在紫斑牡丹中得出的27.6%。在特異性條帶比例上，CDDP分子標(biāo)記的方法產(chǎn)生的特異性比例為26.79%，遠(yuǎn)高于蘇雪等[6]用RAPD技術(shù)在16個紫斑牡丹品種中的3.33%。與以上分子標(biāo)記方法相比，CDDP法具有操作更簡便、應(yīng)用成本低等優(yōu)點，因此CDDP分子標(biāo)記方法是分析紫斑牡丹品種遺傳多樣性新的可靠的方法。

3.2 利用CDDP分子標(biāo)記技術(shù)進行紫斑牡丹品種鑒別

甘肅是紫斑牡丹主產(chǎn)地，也是早期人工培育紫斑牡丹的中心。成仿云等[21]利用自然雜交和人工雜交的方式培育出了500多個紫斑牡丹新品種。在不定向的人工雜交過程中，60余個中原牡丹品種被引入，導(dǎo)致紫斑牡丹更加多元化的遺傳背景。遺傳多樣性的最直接反應(yīng)是形態(tài)多樣性。紫斑牡丹從形態(tài)上表現(xiàn)出極高的多樣性，植株高矮、花色、花型、葉片形狀等均有很大差異。

紫斑牡丹品種群是由野生紫斑牡丹引種馴化形成了一些原始品種后，再由中原牡丹品種的種質(zhì)介入而產(chǎn)生了一大批傳統(tǒng)品種，最后又通過回交和中原牡丹的再次介入產(chǎn)生了許多新品種。最主要和直接的種源是裂葉紫斑牡丹，而矮牡丹和陽楊山牡丹通過中原牡丹間接地產(chǎn)生了影響。目前尚沒有文獻關(guān)于紫斑牡丹品種間鑒別的報道，一般研究多偏向于紫斑牡丹遺傳多樣性的分析，關(guān)于品種鑒別研究收獲較少，只有蘇雪等利用RAPD技術(shù)將16個紫斑牡丹品種區(qū)分開來。本研究采用特異條帶加單一引物鑒別的方式，將統(tǒng)計出的0、1條帶轉(zhuǎn)化為十進制數(shù)，分析比較后一共區(qū)分出了39個品種，品種鑒別性高，可為以后紫斑牡丹品種鑒別提供新方向。

種質(zhì)資源保護及優(yōu)良品種選育的重要前提就是對不同種質(zhì)資源的精確鑒定和遺傳多樣性描述[22]。根據(jù)條帶分析，引物11鑒別性最強，共可以鑒別13個品種，這是截至目前紫斑牡丹品種鑒定中突破前人研究的成果。這些特異性標(biāo)記是區(qū)分紫斑牡丹品種的關(guān)鍵信息，在紫斑牡丹品種的特征描述、保護和開發(fā)利用中起到至關(guān)重要的作用。